化学物质、病毒和癌基因等方法转化细胞的技术

1）致癌化学物转化细胞：转化叙利亚地鼠胚胎细胞实验

1．取材：妊娠后第13天取材，取数个同窝胚胎，去头和内脏，在无菌条件下剪碎至米粒大小，再用0.25%胰蛋白酶（含0.01%EDTA）37℃消化30分钟，滤过、低速离心、吸除消化液、加入营养液、制备成细胞悬液、接种入75cm/培养瓶中，接种密度10～20×106/75cm，37℃培养2～3天，在顺利情况下能迅速长满瓶面。

2．贮存：选大批生长状态良好的细胞冻存，储以备用。

3．致癌物处理：取冻存细胞，解冻，接种于25ml培养瓶中，每瓶含细胞10万～30万。待细胞生长进入指数增生期时，向培养瓶中加入致癌剂MNNG。致癌剂量1～3微克/毫升营养液。在37℃温箱中培养12～48小时。

4．低血清培养：弃掉MNNG作用液，用温PBS洗1～3次，加入含20%小牛血清，继续置温箱中培养2～3周，然后改用含5%血清培养液培养。低血清培养液不利于正常细胞生长，但已转化的细胞仍能增殖和形成转化灶。

5．转化灶形成和分离：在成功情况下，用致癌物处理过的细胞于10天后在正常细胞之间，可产生数量不等的转化灶。

2）病毒转化细胞

1．血液制备：柠檬酸（Citric Acide）或肝素抗凝取血1～2ml，分装入管中，每管0.5ml全血，置于4℃冰箱中30分钟。

2．EBV病毒转化：从液氮中取出冻存的0.5ml全血，在37℃水中迅速解冻。

3．将解冻细胞与10ml不含血清的RPMI 1640混合，2500 rpm离心2分钟，弃上清，用含20%的胎牛血清、青、链霉素和庆大霉素的RPMI 1640生长培养基重悬细胞。

4．加入0.3～0.5ml的EBV病毒液，37℃水浴30分钟～2小时，并不时摇动，以免出现凝块。

5．分装入50ml的培养瓶中，同时补加适量培养液，置入含5%CO2温箱中，100%温度下培养。

6．一周后加补入2ml培养基。

7．经常镜检培养物，每3～4天加液或换液，随细胞数量增多，可分装入大瓶中培养。

3） 癌基因转化细胞：基因组DNA转染法

1．提取基因DNA（含癌基因）。

2．DNA准备：取供体DNA50～100微克，加3M NaCl或醋酸钠使最终浓度至0.3M混匀。

3．再加2倍体积无水乙醇，3000转/分离心10分钟，去上清。

4．加入转染缓冲液，待DNA充分融解后，再加入2.5M CaCl2，令最终浓度为125mM，用吸管轻轻吹打三次。置室温下10～30分钟，待液体透明度降低，出现微浊蓝色时，即可用于转染受体细胞。

5．细胞：取生长状态良好、处于半汇合阶段的指数增生期细胞，在转染前24小时，更换培养液1次。

6．转染：向每瓶中加DNA－磷酸钙沉淀物0.5～1ml/瓶，置37℃作用4～6小时。

7．培养：弃去培养液，用15%甘油处理3分钟，无血清培养漂洗1次，加入新培养液，37℃温箱培养24小时。

8．传代：按1：5或1：10分瓶传代，每2～3天换液1次，接近汇合时血清用量降至5%，培养2～3周。

9．检测：逐日观察，待出现转化灶后，分离入另瓶中培养。