几种常用转化细胞和转化技术

致癌化学物转化细胞:

转化叙利亚地鼠胚胎细胞实验

实验步骤:

1、取材:妊娠后第13天取材,取数个同窝胚胎,去头和内脏,在无菌条件下剪碎至米粒大小,再用0.25％ 胰蛋白酶 (含0.01％EDTA)37℃消化30分钟,滤过、低速离心、吸除消化液、加入营养液、制备成细胞悬液、接种入75cm/培养瓶中,接种密度10～20×106/75cm,37℃培养2～3天,在顺利情况下能迅速长满瓶面.

2、贮存:选大批生长状态良好的细胞冻存,储以备用.

3、致癌物处理:取冻存细胞,解冻,接种于25ml培养瓶中,每瓶含细胞10万～30万.待 细胞生长 进入指数增生期时,向培养瓶中加入致癌剂MNNG.致癌剂量1～3微克/毫升营养液.在37℃温箱中培养12～48小时.

4、低血清培养:弃掉MNNG作用液,用温 PBS 洗1～3次,加入含20％小牛血清,继续置温箱中培养2～3周,然后改用含5％血清培养液培养.低血清培养液不利于正常细胞生长,但已转化的细胞仍能增殖和形成转化灶.

5、转化灶形成和分离:在成功情况下,用致癌物处理过的细胞于10天后在正常细胞之间,可产生数量不等的转化灶.

病毒 转化细胞

实验步骤:

1、血液制备: 柠檬酸 (Citric Acide)或 肝素 抗凝取血1～2ml,分装入管中,每管0.5ml全血,置于4℃冰箱中30分钟.

2、EBV病毒转化:从液氮中取出冻存的0.5ml全血,在37℃水中迅速解冻.

3、将解冻细胞与10ml不含血清的RPMI 1640混合,2500 rpm离心2分钟,弃上清,用含20％的胎牛血清、青、链霉素和庆大霉素的RPMI 1640生长培养基重悬细胞.

4、加入0.3～0.5ml的EBV病毒液,37℃水浴30分钟～2小时,并不时摇动,以免出现凝块.

5、分装入50ml的培养瓶中,同时补加适量培养液,置入含5％CO2温箱中,100％温度下培养.

6、一周后加补入2ml 培养基 .

7、经常镜检培养物,每3～4天加液或换液,随细胞数量增多,可分装入大瓶中培养.

癌基因转化细胞:

基因组 DNA 转染法

实验步骤:

1、 提取基因DNA(含癌基因).

2、 DNA准备:取供体DNA50～100微克,加3M NaCl或醋酸钠使最终浓度至0.3M混匀.

3、 再加2倍体积无水乙醇,3000转/分离心10分钟,去上清.

4、 加入转染缓冲液,待DNA充分融解后,再加入2.5M CaCl2,令最终浓度为125mM,用吸管轻轻吹打三次.置室温下10～30分钟,待液体透明度降低,出现微浊蓝色时,即可用于转染受体细胞.

5、 细胞:取生长状态良好、处于半汇合阶段的指数增生期细胞,在转染前24小时,更换培养液1次.

6、 转染:向每瓶中加DNA－磷酸钙沉淀物0.5～1ml/瓶,置37℃作用4～6小时.

7、 培养:弃去培养液,用15％甘油处理3分钟,无血清培养漂洗1次,加入新培养液,37℃温箱培养24小时.

8、 传代:按1:5或1:10分瓶传代,每2～3天换液1次,接近汇合时血清用量降至5％,培养2～3周.

9、 检测:逐日观察,待出现转化灶后,分离入另瓶中培养.