糖类介绍--糖文库

糖类介绍--糖文库

糖

在体内的高聚物中, 糖是最后一个待发掘的领域. 糖与脂肪和蛋白质并列为三大营养物, 但是蛋白质构成酶和骨骼结构, 脂肪构成细胞膜, 而糖并没有吸引太多的关注. 由于其分子式(CH ₂ O)n使得它看起来像是用碳和水做成的.我们容易注意到它的名字来自"碳的水和(carbohydrate)". 糖的结构被发现之前己经有一些混合碳和水以合成糖的尝试. 葡萄糖, 糖的基本元素之一, 被推测是由光合作用合成然后以糖原或淀粉形式储存. 然而, 最近发现构成细胞膜的许多脂肪或蛋白质是以糖蛋白或糖酯类形式存在, 而且糖低聚物在细胞间信号传递中也起了重要的作用. 另外, 血型抗原也是血细胞膜表面上的糖. 由于糖在HIV或其它致病源与血细胞结合过程中扮演了重要的角色, 它成为免疫系统控制和癌症治疗的最重要的线索之一.

然而糖研究中也存在一些问题. 首先, 自天然产物提纯得到纯净的糖聚合物是非常困难的, 合成也是. Frederic Sanger 因其在蛋白质结构, 尤其是胰岛素上的工作而获得1958年诺贝尔奖, 而且由于他对核酸碱基序列测定的贡献于1980年再次获奖. 除了很少的例外, 基本上蛋白质或核酸是由确定位置连接而成的线形聚合物. 与之相比, 因为糖包含许多能与单体成键的羟基所以可合成的聚合物的组合可能远大于蛋白质或核酸的. 而且, 糖甚至能在其线形聚合物上伸出侧链, 这让推断纯净的天然糖结构非常困难. 除此之外, 核酸如mRNA等作为遗传表达的蓝图, 蛋白质作为基因表达初产品, 仅通过复制和翻译过程, 产生的都是相同的聚合物. 因此, 相对等量的聚合物能被分离. 如果产量不足, 对于核酸以 PCR 法, 对于蛋白质以微生物法倍增和提纯. 然而, 因为在糖合成中没有如核酸那样的蓝图因而糖仅是包含由环境不同而产生的多种组分, 保持相似的结构, 很难得到相同结构的糖, 而且也没有发展倍增技术. 如果我们将核酸或蛋白质比作保持体形统一的动物, 那么糖就是植物, 有不同的枝叶有不同的形状.

在典型的糖结构分析中, 聚合物被以强酸切割为单体, 只有单体末端的糖以酶或温和的化学反应方法结晶化, 这需要巨大的时间和精力. Oxford Glycosystem 的RAAM 2000是市面上唯一的自动化糖结构分析仪, 但是它有众多限制且价格昂贵. 另一方面, 尽管有发展固相合成的尝试, 不同于蛋白质或核酸, 目前仍然没能产生标准方法, 而且距与蛋白质或核酸类似的自动化糖结构分析和合成还有很长的一段路要走. 因此, 这个领域的研究具有诞生新的诺贝尔奖得主的潜力.

糖聚合物的结构多样性

如先前提到的, 糖不像蛋白质或核酸那样, 它包含许多可成键的羟基. 但是, 不是所有的羟基都能成键. 糖给体的还原末端(通常C1或6碳糖的异构体成键位置)通过与糖受体的非还原羟基成键而形成缩醛结构.

 给体与受体

举例来说, 每个单体6碳糖, 例如葡萄糖, 半乳糖和甘露糖等含有可还原末端和四个非还原羟基. 因此, 有四种方法使二个相同的单体聚合. 另外, 由于糖能形成a- 和 b- 立体异构, 所以一共有八种不同方法. 这还不全. 糖还有五原环吡喃糖形式, 所以还有更多的连接方法.

既然如此, 为了方便, 我们还是说说通常的吡喃糖的聚合物. 核酸有四个单体(A,C,G和T(U))共有4x4=16种可行的二聚体, 而20种氨基酸构成的蛋白质能得出400(20x20)种二聚体. 虽然有几十种不同的糖, 我们仅考虑含有还原末端及4个非还原羟基的糖的聚合体. 糖给体如核酸一样有16种二聚体, 但是糖受体给出另外的4个氢氧根, 这样总组合数变成64. 考虑到a- 及 b- 立体异构, 可有128种. 这赶得上20种氨基酸构成的蛋白质的数量. 实际上, 如果是5er的组合, 那就比蛋白质多了. 我们跳过了五原环型吡喃糖以及带4mer或更多支链的. 因此, 糖能有较蛋白质和核酸等聚合物更多的多样性.

活细胞中的糖苷

淀粉和纤维素是在活的细胞中发现的糖苷, 而且它们是葡萄糖C1和C4连接的聚合物, 仅在a- 或 b-立体异构连接的构象上有所不同. 就由于这点不同, a-连接的淀粉通常解离成葡萄糖被当作营养物使用, 但是b-连接的纤维素是重要的构建植物结构的材料, 可被特种微生物消化. 在草食动物腹中, 有这种微生物以分解纤维素. 如果能有方法降解纤维素为葡萄糖, 那将是对食品不足的巨大帮助. 已有一些使用纤维素作为饲料的实验.

然而, 不仅前才发现糖不但能被用作营养物, 而且能成为活体生物的构架分子. 随着基因工程学和蛋白质工程学的发展, 大量获得某种蛋白质成为可能, 这些蛋白质以前我们只能通过向微生物内插入基因而得到少许. 通常动物蛋白在合成之后与糖形成糖蛋白, 但是原核生物缺乏使用糖处理蛋白质的功能因而它们的蛋白质没有糖成份. 虽然重新组合的蛋白质保持了相同的氨基酸序列和原始的功能, 人们对蛋白质的糖部分的功能仍表现出兴趣. 与原核生物的没有糖结构的蛋白质相比(除了细胞壁中的蛋白多糖), 真核细胞的绝大多数的蛋白质除了血清白蛋白以外都有糖. 对于解释糖蛋白的功能和生物学应用所做的许多努力开创了一个新的研究领域, 叫做糖苷生物学.

因为糖蛋白中的糖有十种或更多单体, 理论上可能的组合简直就是天文数字. 如果我们必须考虑所有的可能性, 对糖功能的研究将是不可能做到的. 幸运的是, 人们发现糖结构有很多共同形状.

糖蛋白的糖进入可被分为O-多糖和N-多糖. O-多糖具有N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的结构, 还原末端连到丝氨酸或硫代羟基侧链上, 而N-多糖具有N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的结构, 还原末端连到天冬氨酸侧链上. 通常知道 N-多糖比O-多糖长, O-多糖影响蛋白质的物理化学性质, 而N-多糖在细胞表面上被表达并且用作细胞间传递信号的分子. 每个N-多糖有5er的Man1-6(Man1-3)Man1-4GlcNac1-4GlcNAc. 但是最近发现的O连GlcNAc的结构非常普通而且有活力, 因而推测它就像蛋白质功能中的蛋白质磷酸化作用一样重要.

另外的一个重要的糖蛋白是其C-末端连到GPI(糖基磷酸肽肌糖)上的结构, 这将细胞外蛋白质和细胞膜相连. 通常的GPI结构是肌糖通过磷酸基被连到二甘油酯上然后很多糖被连到甘露糖上. 通过GPI连接到细胞膜上的蛋白质与穿越细胞膜的蛋白质不同, 因为它们可被PI-PLC(磷酸肽肌糖特异性磷酯酶C)分离到细胞外的空间. 与糖蛋白不同, 糖酯类是糖连到酯类上, 例如鞘氨醇(Sphingosin)或神经酰胺(Ceramide). 糖蛋白也有相对短些的结构.

< http://www.cchem.berkeley.edu/~crbgrp/ >

另一方面, 肽聚糖是与糖蛋白完全相同因为它们的肽或蛋白质都连于糖上, 但是不同的是肽聚糖有硫酸根等阴离子而且两个糖单体被重复. 肽聚糖中有肝磷脂钠, 软骨素, 透明质酸等.

糖聚合物的生物作用

当科学家试着去识别葡萄糖复合物分子的糖结构时, 它们令人惊异的复杂度和多样性被发现. 最近有一些关于糖分子具有重要的生物学作用的报道, 但是还没有提出一个理论以解释众多现象. 到目前为止所发现的糖分子的角色和功能有支持细胞和蛋白质的结构角色, 微生物, 毒素还有抗体的连接位供体或掩体, 调控蛋白质功能, 以及在细胞间相互功能的中介物. 然而, 每个研究都是以一种多聚糖或一种功能为基础的, 还没有报道统一的理论.

结构作用 : 长期以来已经知道糖分子在生物结构的支持, 细胞间连接, 多孔性支持等方面扮演了重要角色. 另一方面, 在细胞表面上, 糖分子覆盖了细胞膜中糖蛋白的表面而且保护它免于受蛋白酶或抗体的破坏.

肽稳定作用 : 核糖体合成的蛋白质在ER(内质网)上或高尔基体内变成糖蛋白, 先前形成的糖分子帮助蛋白质折叠到现在的形状. 那就是说, 如果糖不与蛋白质成键, 蛋白质将变成错误的形状或者被分解, 因为它出不了内质网. 然而, 也有一些报道说糖的连合并不影响蛋白质的合成, 折叠, 和到最后的目的地的传递. 同样, 一些报道说虽然糖的部分被从成熟的蛋白质上切除, 这几乎不影响蛋白酶和抗体的功能.

结构作用 : 细胞外结构包括多种당결합체, 每种都有与多种糖结合的位点. 最近发现这些成键位点有重要作用.

毒素受体作用 : 一些糖成为特定病毒, 细菌或寄生虫的受体. 也有一些成为毒素或免疫系统的抗体的受体. 在大多数的如此情形中, 糖表现了对目标的高度特异性.

毒素抵御及诱饵作用 : 如前所述, 一些糖给了宿主生物不好的作用, 还有一些糖阻止这样的作用发生. 有两类防卫方法: 一是抑制细菌或毒素受体位点, 另一个是糖如诱饵一般主动与侵略者结合而不是让它们与受体结合.

共生作用 : 一般知道, 和寄生虫或入侵者相反, 共生伙伴也选择性的绑到宿主细胞表面的糖上. 例如一些有用的带根的蠕虫或微生物. 据推测这是由于宿主和寄生虫共同进化的结果. 如果它们不通过采取共生的方式而持续变异, 宿主将尝试抵御入侵者而入侵者将寻找新的结合位点.

蛋白质功能开关作用 : 一些细胞膜受体通过糖键与生长激素结合. 这个功能好像是帮助抑制生长因子产生以后所引起的不必要的受体活化. 这时, 糖键起到的是蛋白质功能开关作用. 相同的糖开关适用于与受体结合的激素. 举例来说, 如果一个非活化的肽激素能与受体结合, 那就像将一个竞争者变成了一个对手.

储存活性分子作用 : 最近的研究报告糖聚合物表现出重要的生物储存作用. 已知生长因子能利用肝磷脂等糖载体的亲和色谱提纯, 所以, 有人提出一个假说, 即一些生长因子与细胞外载体强烈成键, 等待被活化. 而且这些键对蛋白酶的不加选择的分解生长因子可以起到抑制作用. 这将长时间维持活化的生长因子的功能.

激素作用 : 真正的糖聚合物可能是激素. 植物激素Oligosaccharins表现了很高的独特性, 是个好例子. 椎骨动物体内甘露糖聚合物表现出了高度的抑制作用.

细胞间传递信号作用 : 由于每个细胞布满高浓度的糖, 有人推测糖会在细胞间相互功能中发挥重要作用. 然而, 除了糖会与selectin和lectin成键外, 实际上这种功能还没有清楚的识别.

 参考: Varki, A glycobiology, 1993, 3, 97-130 

糖与蛋白质的键合

白血球通常快速环流于我们体内, 而且当一个炎症被发现的时候, 他们穿透血管并移动到身体内部. 有一种称为选择凝集素(selectin)的蛋白质, 它连接到糖上而且有如黏合剂一般将白血球固定到受伤的血管位置上. 但是整体凝集素(integrin)和免疫球蛋白也参与该反应.

虽然仍不能清楚地识别, 但是通常已知的功能如下: 在发炎的血管壁之间的Selectin与循环白血球互相影响以减少白血球的旋转. 因为selectin的旋转是不足以固定白血球, integrin参与的功能使白血球均一地黏到血管壁上. 然后白血球渗透过松弛的血管.

有三种Selectin; E(内皮)-, P(血小板)-和L(白血球)-selectin. 每个selectin都将氨基末端连接到糖上.

E-selectin是95-115 kD的一个糖蛋白, 是在被IL-1和 TNF或LPS等细胞因子(cytokines)刺激的内皮细胞中发现的. 表达包括新的蛋白质合成, 在刺激之后4-6小时达到峰值, 在24个小时后回到最初状态. 与E-selectin结合的糖配体在中性粒细胞(neotrophiles)或巨噬细胞(macrophages)表面上的糖蛋白或糖脂(glycolipids)中被发现.E-selectin在白血球在发炎的内皮细胞上旋转的时候起重要作用.

P-selectin 是140 kD的蛋白质, 位于血小板或内皮细胞的分泌颗粒(secretory granules)中. P- selectin表达不包括细胞因子, 但是是在内皮细胞被凝血酶或组胺刺激时的几分钟内发生的. P-selectin 用来将中性粒细胞与内皮细胞或血小板成键.

L-selectin是一个在所有的白血球中都表达的糖蛋白. 它在淋巴球的正常再流通和与비림프조직成键中起到了非常重要的作用.

所有三种selectin都与Lewis a (sLea) (NeuNAc-2-3Gal-1-3(Fuc-1-4)GlcNAc)成键, 它是Lewis X (sLex) (NeuNAc-2-3Gal-1-4(Fuc-1-3)GlcNAc)的异构体. 它们在活细胞中好像是作为E-和P-selectin的配体, 也可用于其它硫酸化糖, 但是它们的特定结构现在还不能识别.

糖分析

为测试糖是否被包含在从活细胞内取出的蛋白质中, 过去一直使用苯酚-硫酸颜色分析法, 但是它的低敏感对现在的生物化学研究而言是不合适的. 现在正在使用的是免疫颜色法(면역착색법), 通过切割羟基邻接的糖得到高活性的醛, 或着使用维生素H-straptavidine(스트랩타비딘) 形成的配合物和磷酸酯酶的方法.

为分析糖蛋白类型中糖聚合物的结构必须被首先分离糖和蛋白质, 这需要化学方法和酶方法. 在化学方法中, 可以通过使用肼迅速分开O-或N-连接的糖并控制条件仅分离O-连接的的糖. 然而, 当肼被用于反应时, N- 乙酰基在反应中被切割掉于是需要额外的乙酰化步骤. 如果在一些胺的第一个位置没有胺上的乙酰基那就没有办法分离. 因为肽结构在肼反应条件下被分解, 还有蛋白质分析的问题.

在酶方法中, 用肽N-糖苷酶F(PNGase F)分离N-连接的糖是可能的而且有用的. 可是, 能与O-连接的糖广泛反应的酶还未被发现. 当糖被分离的时候, 为便于分析, 通常还原末端被萤光或放射性分子标记. 在元素分析之前, 首先用硅胶色谱测体积, 用阴离子交换树脂测离子数. 然后, 用HCl或TFA等酸做糖水解以得到单糖, 然后以GC或HPLC给出相对量. 这个过程与分析蛋白质时的氨基酸分析类似.

剩下的工作是决定糖的整个结构, 包括单糖的种类, 序列, 与羟基连接的位置, 异构体的三维结构, 侧链的结构, 单糖的光学结构, 以及化学分析如磷酸化作用, 硫酸化作用和甲酸化作用等. 还没有能够获得所有数据的简单过程, 于是就采用了NMR, 质谱, 酶分析等方法, 但是仍然耗费了大量时间和精力. 自动化RAAM(试剂排列分析方法)混合了几种酶, 能选择性分离一些试剂, 并通过与现有数据库比较得出糖结构. 然而, 由于可得到的酶的限制, 这种方法仅对已知基本结构的N-连接的糖有效, 不能用于O-连接的糖或者全新结构. 这个领域仍然迫切需要划时代的解决办法.

糖文库的合成

糖文库开始的时间比蛋白质或核酸文库晚很多. 最初, 一般认为蛋白质控制了活细胞大部分重要的活动而糖是只是部分参与结构构建和能量储藏. 然而, 最近肌醇等糖系列的信号传递分子被发现而且糖的多种功能被揭示之后, 糖变成了新的文库候选人.

第一个文库由 Daniel Kahne ( Science )报道. 他的文库是带有各种取代基的糖结构文库. 也就是说, 虽然它是一个糖文库, 它是一个与天然糖结构不同的小分子型文库.

 Kahne论文中的文库结构

< http://www.princeton.edu/~dkahne/index.html>

天然的糖是各种不同的糖被糖苷键连接而成的低聚物. 糖苷键 可被看作醚键, 但是实际上它的水解比醚更容易. 人们早就知道由于产量和a, b立体选择性的问题合成糖苷键的反应不容易. 除此之外, 用其保护多个羟基也是一个争议.

Scripps研究所的 Wong 推进了通过几步快速糖苷反应无需过滤而合成低聚物的研究. 他研究了糖苷反应中的几百种糖的反应活性然后建造反应速率数据库. 他的策略是选择反应活性有显著差异的糖来做反应. 然后, 高反应活性的糖将会首先反应, 而低反应活性的糖将会在相对高活性的反应完成之后再反应, 这样就合成了低聚物. 为获得高纯度, 所选择的糖的反应速率必须有显著差异. 因此, 实际上可能的糖苷反应被限制在3或4种.

  Wong的一罐反应策略

如固相肽合成一样, 在哥伦比亚大学的 Samuel Danishefsky 主要研究糖低聚物的固相合成. 他利用用烯糖作糖给体的方法的发展提出了可能的合成糖低聚物的自动化系统. 还有 Seeberger , Danishefsky以前的学生, 建造了一个能够做固相糖低聚物合成的自动化合成仪. 尽管由于低产量它只能合成10个或更少的低聚物, 但它是给这个领域以革命性发展的一个开创新纪元的方法.
　

 自动寡糖合成仪的产物(Seeberger)

  Kahns, Wong, Danishefsky, Seeberger