大肠杆菌质粒DNA的提取及转化
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实验步骤
碱裂解法:此方法适用于小量质粒DNA的提取,提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下:
3) 取1.5ml菌体于Ep管,以4000rpm离心3min,弃上清液。
4) 加0.lml溶液I(1%葡萄糖,50mM/L EDTA pH8.0,25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5) 加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH,1% SDS),轻轻翻转混匀,置于冰浴5 min 。
6) 加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc,pH4.8),轻轻翻转混匀,置于冰浴5 min 。
7) 以10,000rpm离心20min,取上清液于另一新Ep管
感受态的细胞可以摄入外部溶液中的DNA,而常态的细胞却不能,所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。
1) 取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培养基的试管中,37℃振荡培养过夜。
2) 取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培养基的三角瓶中,37℃振荡培养3h至OD600=0.3。
5) 把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2 溶液中,置冰上30min。
6) 然后再在4℃下以4000rpm离心10min,去上清液。
7) 将菌体悬浮于0.1ml CaCl2 溶液中,冰浴放置4-12hr备用。
制备好感受态细胞后,接下来就是质粒DNA转化入大肠杆菌细胞的过程。但要注意的是感受态细胞最好是新制备的,因为保存一定时间的感受态细胞会使转化率降低;此外DNA的浓度也要注意,不能太高。
2) 取0.03ml感受态细胞转和4ng质粒DNA混匀,置冰浴30min。
3) 将 Ep管置于42℃水浴中热冲击2分钟,立即置于冰上1分钟。
4) 在 Ep管中加70u1 LB培养基混匀,37℃培养30min。
1) 质粒DNA和CIAP以及BUFFER 37℃水浴30min。