互联网2013-11-13
HrpNEa 是植物病原细菌E. amylovora产生的一种多效型蛋白，用其处理拟南芥能激发脱落酸和乙烯信号介导的抗旱和抗虫过程。ABA和乙烯两种激素都参与了种子萌发和根生长，但在植株地上部分的抗虫性和促生长中只有乙烯是需要的。随着在缺水条件下HrpNEa 应用于生长植株的地上部分，ABA介导的干旱被启动而此过程有不需要乙烯的参与。
1. 拟南芥野生型Co-0及其突变体etrl -1，ein2-1和ein5-1，另一野生型Ler-0及其突变体abil-1和abi2-1。种子保存于-20℃冰箱内。播种前，种子需要用10%(vlv)的次氯酸钠溶液消毒3分钟，并置于4℃春化3天。处理后的拟南芥种子，播于大小60 ml含沙土混合物的盆钵中生长，20天后用于抗虫和抗旱测定。所有实验用拟南芥生长环境均是:光暗周期14h/10h、温度光照24℃以及黑夜20℃下。
2.桃蚜，用于接种拟南芥的蚜虫为无翅孤雌胎生蚜。所有供试蚜虫均用萝卜苗室内饲养；置于外罩100目双层沙网的50 cmX50 cmX50 cm正方体铁架内，饲养条件为((20-22)℃，相对湿度60 %-70%。
1. HrpNEa 的制备
HrpNEa 表达菌株为大肠杆菌DH5α，内含质粒PCPP2139的，其中质粒PCPP2139是由HrpNEa 的编码基因HrpNEa 构建于载体PCPP50所产生。 EVP是阴性对照或称空载体，为仅含PCPP50空载体的大肠杆菌DH5α所表达的无活性蛋白质。HrpNEa 和EVP的浓度用BCA蛋白检测试剂盒(Epicenter Biotechnologies，Rockford，IL)进行鉴定，使用浓度均为15ug/ml。
2. 植物材料处理和诱导表型的测定
1) 用15 ug/ml的HrpNEa 和EVP喷雾处理生长20天的拟南芥植株，处理5天后，移植无翅孤雌胎生蚜，每株30头，观察随后的蚜虫繁殖数量，确定抗虫表型。
2) 对盆钵中生长的拟南芥正常浇水，使土壤湿度为45%，植物组织的水分含量为85%，而后持续不浇水进行干早胁迫。土壤湿度每天用MPKit (Ruidisheng Sci.&Tech.Co.，Ltd，Jiangsu，China)进行监测。干旱10天以后，再用EVP和HrpNEa 处理植株。抗旱水平通过叶片萎蔫数下降的百分率来判定。
3. 内源ABA和乙烯的测定以及细胞与气孔的显微观察
1) 乙烯浓度通过气相色谱进行测定。生长20天的拟南芥苗经HrpNEa 或EVP处理后，迅速放于用凡士林密封的玻璃缸中，气体从此密封的玻璃缸中采集。
2) ABA从经过HrpNEa 或EVP处理的叶片中提取，测定其浓度。
3) 在显微镜下，用蓝色滤光片观察叶表皮气孔，并测量其孔径大小。
4) 用透射电子显微镜进行观察叶片细胞膜和细胞壁在处理后发生的变化。
4. 药物抑制处理
乙烯的生理作用抑制剂AgNO3 使用浓度是20uM，由于见光易分解，所以应该现配现用；乙烯的生物合成抑制剂氨氧乙酸(amonooxyacetic acid，AOA)使用浓度是0.5mM，可以100mM的母液浓度储存于4℃冰箱，备用。ABA生理作用抑制剂Fluridone配成100mM的母液，储存于4℃冰箱，使用浓度是100uM。所有的抑制剂均根据实验要求，单独或与HrpNEa 混合喷雾处理拟南芥植株。
5. 数据处理和分析
每一个实验处理是15棵植株。数据用Microsoft Excel. version 2003中的统计分析工具处理。用T测验勿= 0.05)方法分析诱导处理和对照处理间的显著差异。不同诱导处理间的显著差异，用Mann-Whitney U测验(p= 0.05)进行比较。
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