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乙醇固定样品DNA 抽提和直接PCR

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实验原理

 

在实际的研究工作中,野外取样的地点一旦较为偏远,受条件的限制,很难保证得到的样品活体或能够快速冷冻;另外,对一些稀有物种和濒危种,鲜活样品的采集十分困难,一般为了解决这些问题,常采用乙醇和甲醛固定的方法来处理样品,再对样品DNA 进行提取以及扩增。使用乙醇固定样品具有硬化,固定,脱水作用,对组织渗透迅速,特别适合组织中核酸的保存,相比于甲醛等其它固定方法,此法更简单,保存时间更长质量更好,也更加清洁无害。乙醇固定样品主要应用于水产种质资源鉴定,医院或兽医病理样品保存,法医样品保存等方面,在特定物种基因保护,生物多样性,动物分子标记,司法鉴定等方面有广泛的应用。

Omega Bio-Tek 相应试剂盒既能够快速有效的抽提得到乙醇保存多年的样品基因组DNA,又可以利用直接PCR 系统,快速的对乙醇保存样品进行PCR 鉴定,为您的研究提供最有力的工具。

实验材料

 

乙醇浸泡的鱼苗

实验步骤

 

1. E.Z.N.A. Tissue Direct PCR kit

    1) 分别取45ul AT1 和5ul AT2 到0.2ml PCR 管中,混合均匀。对于有较多样品需要操作的,可以先将AT1 和AT2 用量计算好,混合均匀后再分装到每一管中。

    2) 取鱼苗一条,在AT4 中浸泡约5-10min,滤纸吸干水份。

    3) 将鱼苗浸没在上一步准备的AT1 中56℃水浴或者PCR 仪上消化10-20min,中间可以涡旋混匀一次。

    4) 消化完后的PCR 管置于90℃水浴或者PCR 仪上5min,稍微冷却后加入50ul AT3 涡旋混匀。

    5) 以上裂解液就可以作为PCR 的模板直接使用,PCR 体系中建议加入5ul 左右。

    6) 取5ul E.Z.N.A. Tissue Direct PCR kit 抽提得到的一条鱼苗的DNA 作为模板,客户提供的引物Y-30-R/F 作为引物,PCR 扩增。

    7) PCR 扩增程序:

        94℃ 2min;

        94℃ 30S 52℃ 30S 72℃ 40S 33cycles;

        72℃ 5min;

        25℃ forever。

2. E.Z.N.A.® MicroElute® Genomic DNA Kit

    1) 称量10mg 组织,加入200ul Buffer TL;

    2) 加20ul OB,55℃孵化至完全降解;

    3) 13,000xg 离心2min,转移上清至新管;

    4) 加220ul Buffer BL 涡旋混匀,70℃孵化10min;

    5) 加220ul 无水乙醇,最大速度涡旋15s;

    6) 将混合液过柱吸附,13,000xg 离心30-60s,弃滤液;

    7) 加500ul Buffer HB,离心;

    8) 700ul DNAWash Buffer(加乙醇);

    9) 13,000xg 离心2min,干燥柱子;

    10) 加25ul 70℃预热的Elution Buffer 洗脱。

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