测定用乙醇固定的 DNA 的含量

一、培养细胞的 DNA 含量的测定

制备单细胞悬液于 200μ l 的 PBS 缓冲液中； 加入 2ml 预冷的 70%乙醇，4℃保存；

附：细胞固定的一般步骤

1. 取单细胞悬液 1～2×106 个细胞于 PBS（PH=7.2）缓冲液中；

2. 300g 离心 5 分钟，弃上清，反复两次；

3. 重悬细胞于 0.5ml PBS 缓冲液中；

4. 将细胞悬液放置于 2～3ml 冷 70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30 分钟。 在 4℃条件下可保存 2~3 周。

注意：

1. 根据实验的要求，固定剂也可选用 1～3%多聚甲醛；

2. 将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至 0～4℃；

3. 细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增 加，并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时） 。

4. 300g 离心 5 分钟，去上清，再重悬于 400μ l PBS 中；

5. 显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤；

6. 加入 PI（含 Rnase） ，避光孵育30 分钟；

7. 上机检测。

2、新鲜组织的 DNA 含量的测定

1. 用 200mg 湿重组织用机械法制成单细胞悬液；

2. 500g 离心 5 分钟；

3. 弃上清，重悬于 10ml 染色- 去污剂中；

4. 再过滤，用 200 目的筛网或 70~80μm 的筛网过滤；

5. 上机检测。

3、石蜡包埋组织切片的 DNA 含量的测定

1. 从石蜡包埋切取切片 50 μ m 厚，2~3 片，制成单细胞悬液；

2. 用 PBS 缓冲液洗涤，500g 离心 5 分钟，弃上清；

3. 加入 PI 液 1ml 室温避光 30 分钟；

4. 调整细胞浓度为 1×106/ml；

5. 上机检测。