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小鼠原代小胶质细胞吞噬功能的分析

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实验步骤

 

为了检测小胶质细胞的吞噬功能,利用凋亡的神经祖细胞作为目标,因为在体外环境下它能最模拟自然条件下小胶质细胞的吞噬目标。

1. 将神经祖细胞(NPC)置于0.1M PBS 2mg/ml木瓜蛋白酶(Worthington)溶液中进行分离,37ºC作用30min。

2. 将分离的NPC 在紫外光下处理15-20min。

注:此步应该在一个很薄的塑料培养皿中进行,厚的塑料(如15或50毫升锥形管)将阻止很大部分紫外线光,导致细胞凋亡不理想。

3. 用含40mL PBS(RT)的50 mL锥形管中洗NPC,室温离心(1200 转/min,7min),缓慢减速,弃掉上清液。

4. 室温条件下在5 mL 0 .1 M PBS溶液中重悬NPC。

5. 向NPC中加入5mL sta 5(6)-TAMRA,SE(Invitrogen公司),立即涡旋, 37ºC避光孵育15min。

6. 用40 mL预冷的0.1M PBS洗3次(如步骤3)。

7. 将NPC悬浮在1 mL DMEM / F12(Invitrogen公司)培养液中双抗(Invitrogen公司),用血球计数板计数细胞。稀释或浓缩细胞数至5 ×10 6 每毫升。

8. 按10:1的比例,将NPC加至小胶质细胞(已经吸附于24孔板中盖玻片上),加入含10%胎牛血清(Atlanta生物)双抗的900mL DMEM / F12培养基。

9. 置于37℃和5%CO2 培养箱中培养。

10. 在所需的时间点(如1h,2h和5h)从培养箱中拿出。

11. 在无菌环境中,用钳子拿出盖玻片,在温热的PBS中轻柔的浸洗20次(除去未吞噬的NPC)。将盖玻片置于含1mL4%PFA的24孔板中,再次放置盖玻片于培养箱中等待下个所需的时间点。

12. 将细胞固定于盖玻片上,避光20min,用0.1M PBS洗3次。

13. 用含10%血清、0.3%的Triton X-100和0.5%BSA的PBS溶液,避光作用1小时封闭盖玻片。

14. 滴加CD11b的抗体(1:100)(eBioscience),避光,常温孵育1h。

15. 用0.1M PBS洗盖玻片3次PBS。

16. 滴加二抗(1:1000,Invitrogen公司),室温下孵育1h。

17. 用0.1M PBS洗盖玻片1次PBS。

18. 滴加DAPI(1:20,000)孵育5min。

19. 用0.1M PBS洗盖玻片3次PBS。

20. 用Aqua-Mount封片剂封片。

21. 通常情况下, “吞噬指数”可以根据CD11b的小胶质细胞总面积除以NPC标记的总面积来计算。

22. 在共聚焦显微镜下用Z- stacks拍照检验NPC吞噬实验的有效性。

 

 

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