聚丙烯酰胺凝胶电泳(圆盘电泳)
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实验原理
实验试剂
0.5mol/L Tris(三羟甲基氨基甲烷)60.57 g
0.04mol/L EDTA (乙二胺四乙酸) 11.7 g
5. 0.025mol/L pH值9.0硼酸缓冲液(电泳槽用)：
实验步骤
1. 样品处理：取待检样品与标准品(对照)各0.1ml，加入0.5%溴酚蓝指示剂各1滴，再加入25%蔗糖各0.1ml，混合均匀备用。
3. 加样：用毛细管吸去凝胶管上端的蒸馏水，缓缓加入已处理的样品于凝胶柱面上，每种样品加1管。每管留0.5ml空处，再加入蒸馏水至满。操作过程不得产生气泡和冲击凝胶面。
1) 定性分析：以凝胶染色的区带图样与标准品图样进行对比鉴定。
b. 把凝胶切成等距的薄片，洗脱，用生物化学方法作洗脱液的比色测定；
c. 放射性同位素法，在样品中加入标记同位素，如?3 H、?14 C等，电泳后，用计数器测量放射活性，计算结果。
注意事项
1. 样品的离子强度、pH值尽可能与浓缩胶液相同，如含大量盐时，应经透析除盐。样品的蛋白浓度以1mg/ml为宜。
4. 凝胶应充分聚合，室温低时，可适当延长聚胶时间，在37℃温箱中可促进凝胶聚合。凝胶柱面应整齐，在操作过程中，不要产生气泡，否则电泳后区带不整齐。
5. 电泳中应保持电流稳定，避免电流强度过高，而产生大量的热，使分离失败。
6. 缓冲液可再行使用，但应注意上下槽缓冲液不能混合或互换。因下槽中混入了催化剂及氯离子，如将下槽的缓冲液用于上槽，则影响电泳。
7. 如凝胶浓度较高，剥胶困难时，可用10%甘油水溶液代替水注入。
8. 丙烯酰胺和N，N亚甲基双丙烯酰胺这两种单体，可引起神经中毒与刺激皮肤粘膜的作用，应注意自身防护。
9. 在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入适量(如0.1%)的十二烷基硫酸钠(SDS)为助溶剂，可以测定生物大分子的分子量，研究复合蛋白质的单体性质，获得明晰的电泳图谱。
