变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
最新修订时间：
材料与仪器
40% 聚丙烯酰胺溶液 尿素 甲酰胺 5XTBE 缓冲液 10X 加样缓冲液 过硫酸铵 TEMED 染色液 1%AgNO3 显色液
垂直电泳装置 水浴
垂直电泳装置 水浴
步骤
(一）材料与设备
1) 垂直电泳装置
2) 水浴
3)40% 聚丙烯酰胺溶液: 丙烯酰胺 38 g,N,N-亚甲双丙烯酰胺 2 g，加水至 100 ml，完全溶解后过滤，保存于棕色瓶中
4) 尿素
5) 甲酰胺
6)5XTBE 缓冲液：Tris 碱 54 g, 硼酸 27.5 g，20 ml0.5md/LEDTA(pH8.0)，加水至 1L
7)10X 加样缓冲液:10 mmol/LEDTA(pH8.0)，0.2% 橙 G，50% 甘油
S)10% 过硫酸铵
9)TEMED
10) 染色液 1%AgNO3
11) 显色液:NaOH 10 g，Na2CO3 0.2 g，甲醛 2 ml 加水至 500 ml, 溶解完全后使用，需临时配制。
(二）操作方法
1) 灌胶：根据所分离 RNA 分子的大小、参照寡核甘酸长度与聚丙烯酰胺百分浓度的关系（表 5.1) 选择合适的胶浓度，并根据表 5.2 灌制变性聚丙烯酰胺凝胶
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2) 预电泳:200V 条件下恒压电泳 15〜2Omin
3) 电泳: 在 RNA 样品中加入等体积的甲酰胺，振荡混匀，于 55℃ 加热 5 min, 以消除二级结构。加入 10X 加样缓冲液，200V 条件下用 0.5XTBE 电泳缓冲液恒压电泳。
4) 快速银染：电泳结束后，用蒸馏水洗胶两次；加入适量的染色液染色 10 min; 水冲洗 30s, 用少量显色液冲洗; 加入显色液至条带清楚。
1) 垂直电泳装置
2) 水浴
3)40% 聚丙烯酰胺溶液: 丙烯酰胺 38 g,N,N-亚甲双丙烯酰胺 2 g，加水至 100 ml，完全溶解后过滤，保存于棕色瓶中
4) 尿素
5) 甲酰胺
6)5XTBE 缓冲液：Tris 碱 54 g, 硼酸 27.5 g，20 ml0.5md/LEDTA(pH8.0)，加水至 1L
7)10X 加样缓冲液:10 mmol/LEDTA(pH8.0)，0.2% 橙 G，50% 甘油
S)10% 过硫酸铵
9)TEMED
10) 染色液 1%AgNO3
11) 显色液:NaOH 10 g，Na2CO3 0.2 g，甲醛 2 ml 加水至 500 ml, 溶解完全后使用，需临时配制。
(二）操作方法
1) 灌胶：根据所分离 RNA 分子的大小、参照寡核甘酸长度与聚丙烯酰胺百分浓度的关系（表 5.1) 选择合适的胶浓度，并根据表 5.2 灌制变性聚丙烯酰胺凝胶
2) 预电泳:200V 条件下恒压电泳 15〜2Omin
3) 电泳: 在 RNA 样品中加入等体积的甲酰胺，振荡混匀，于 55℃ 加热 5 min, 以消除二级结构。加入 10X 加样缓冲液，200V 条件下用 0.5XTBE 电泳缓冲液恒压电泳。
4) 快速银染：电泳结束后，用蒸馏水洗胶两次；加入适量的染色液染色 10 min; 水冲洗 30s, 用少量显色液冲洗; 加入显色液至条带清楚。
注意事项
1) 灌胶后一旦拔去梳子，必须立即彻底清洗加样孔，否则由梳子带出的少量聚丙烯酰胺将会在孔中聚合，从而产生会使 RNA 条带变形的形状不规则的加样孔底面
2) 最好用同批配制的电泳缓冲液配胶和电泳，因为离子强度或 pH 值的细微差异都会产生缓冲液前沿，使 RNA 的迁移发生严重变形
3) 在电泳前最好进行预电泳，使过硫酸铵迁移出样品孔，并能将凝胶加温至最适于 RNA 电泳的温度
4) 在加样缓冲液中加入常规示踪染料溴酚蓝和二甲苯青是不可取的，因为这些染枓或其中的杂质可能与 RNA 迁移速率相同，会干扰利用紫外吸收观察 RNA 的效果
2) 最好用同批配制的电泳缓冲液配胶和电泳，因为离子强度或 pH 值的细微差异都会产生缓冲液前沿，使 RNA 的迁移发生严重变形
3) 在电泳前最好进行预电泳，使过硫酸铵迁移出样品孔，并能将凝胶加温至最适于 RNA 电泳的温度
4) 在加样缓冲液中加入常规示踪染料溴酚蓝和二甲苯青是不可取的，因为这些染枓或其中的杂质可能与 RNA 迁移速率相同，会干扰利用紫外吸收观察 RNA 的效果
来源：丁香实验
