蚜虫核基因EF-1 alpha基因序列测定及系统发育分析
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实验材料
实验步骤
3) 碾磨后将离心管置于冰上,重新取下一头成蚜虫放入另一个离心管内,重复第二步;
4) 分别向离心管内加入1.6ul蛋白酶K (10mg/mL );
7) 简单离心后,-20℃保存或用2ul作为PCR反应的模板,立即进行PCR扩增。
使用一对特异性引物(Moran et al.,1999 )扩增蚜虫mtDNA-12S/16SrRNA基因。
上游引物为:5’-GGAAATGGGAAAAGGCTCCTTCAAGTAYGCYTGGG-3';
下游引物为:5’-ATGTGAGCAGTGTGGCAATCCAA -3'。
PCR反应条件为:94℃预变性4min;接着92℃变性lmin,55℃退火1 min,72℃延伸1 min共30个循环。
扩增产物的检测:取PCR反应产物5-9uL,在1.0%(g/mL)的琼脂糖凝胶上60V电压电泳30min,最后在Bio-Rad Gel Doc EQ凝胶成像系统下观察。