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色谱柱预防性保护与柱寿命的延长

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    通常,一根色谱柱在分析数千个样品之后性能仍然保持良好,但也有的柱仅分析不多的样品后几乎就报废了。影响柱寿命和其它问题的因素很多,而有些因素是操作者很难控制的,如果被分析的样品(如分析生物样品),怎么净化样品也是“脏”的,好于色谱柱的影响是非常大的。然而采取下列措施后,在多数情况下总能够人为地减少柱上故障,达到延长柱寿命的目的。

1.加流路过滤器和保护柱
    流路过滤器紧靠进样阀后面,位于分析柱前。0.5μm烧结不锈钢片夹在死体积很小的套子中,挡住来源于样品和进样阀垫圈的微粒入柱。因为每个样品都过滤既费事又带来误差,样品量少过滤更困难,因此流路上装过滤器是比较省事的办法。也可以在流路加上保护柱,放在流路过滤器和分析柱之间,或者代替流路过滤器。保护柱的使命是收集阻塞柱进口的来自样品的化学“垃圾”。这程垃圾最终隐藏低柱效能。保护柱应该是小体积,用分析柱的同种填料填装。保护柱使用得当,对分离无影响,好像未装保护柱一样。有些厂商的商品将保护柱都是用短柱、不超过3cm长,内径2~3mm,用较大粒度的填粒(15~20μm)干法填装,会使分析柱的效能有所降低。

2.避免高压冲击
    一般色谱柱都能经得起高压,但经不起突然变化的高压冲击。引起高压突然冲击,主要是因样品阀的缓慢转动、泵起动快,柱切换操作等。等面已讨论过,转动六通进样阀时从泵到柱的液流会瞬时切断。在阀的泵侧压力升高,在阀的柱侧压力降低(变化超过20%)。阀转到底后压力突然冲击一下恢复正常,手动进样阀的变化不大,自动进样阀比较慢,可能造成压力冲击,可用氦气代替空气驱动进样阀。因氨压缩系数小。另外泵起动不应过快,可分步操作。如用3ml/min流速,先从1mL/min到2mL/min,然后再3ml/min,每个间隔应大于20s。
    柱切换技术的应用也很广泛,切换过程中在色谱柱的入口处压力在零到很大数字之间变化,会很快使柱报废。

3.分离条件
    多数色谱柱有很宽的试验条件范围,但具体应用又受到限制,主要是pH值、柱温和流动相的选择。
    硅胶为基质的键合相要求pH在2.5~7之间,极端pH的流动相能“溶解”硅胶,使键合相流失。结果非碱性组分峰变宽。如果一定要用高或低pH的流动相,可加预柱(饱和柱)。预柱装在泵和进样阀之间,用分析柱相同的填料填装,或者用普通硅胶。硅胶饱和了流动相。减少了分析柱填料的损失。预柱不要求柱效高,用价格低的一般硅胶疏松地填装,按期检查硅胶的溶解情况。用预柱也有不利的影响。即新流动相难以平衡,保留时间不稳定或稳定慢。使用了预柱一定要加流路过滤器,以防止硅胶微粒引起的麻烦。
    以硅胶为基质的柱和阴离子交换柱超过60℃后,会增加对流动相中化学物质的吸附。在高温下用小颗粒柱引起柱床塌陷,降低柱效,改变峰形。在4℃以上使用3μm柱,70℃以上使用5μm柱,会使N值降低50%。
    有些流动相中的溶剂不能用于某些柱,如小颗粒的聚苯乙烯填料不能用于非水的排阻色谱。另一方面,有些柱与某些溶剂(如四氢呋喃)一旦达到平衡,不要随意改用其它溶剂。有关这些特殊填料,可以参见有关资料。
    水溶性流动相会引起微生物生长而造成阻塞柱。色谱柱应存放在纯有机溶剂或加了50%有机溶剂的水中。凝胶柱可存放在水溶性缓冲液中,同时加0.01%叠氮钠以防止微生物的生长。

4.净化样品
    用溶剂溶解的样品,多数组分在一定的时间内能完全从柱中流出来,不会造成危害。
    有些样品可能含有微粒物质,样品中的某种组分(如蛋白质)在柱头上沉积下来,组分在固定相上保留很强,溶剂带走柱填料,等等,这些都会造成柱效能下降或柱寿命的影响,有必要采取措施防止柱变坏。
    如在光线照射下观察样品是浑浊的或带有乳白色,进样前必须要过滤。虽然流路上装有过滤器和保护柱,但不能代替样品的前处理,样品中过多的微粒会使过滤器和保护柱超载,很快阻塞,或者微粒进入分析柱,所以在进样前必须过滤样品。
    若怀疑样品与流动相混合有沉淀而对色谱柱有阻塞,应先试验一下,看样品溶液加入流动相中有无变浑或乳白色出现。如果进样后压力突然增加而后又慢慢减小,表明样品中有微粒或发生沉淀。如有沉淀要设法改变分离条件,包括换样品溶剂和流动相;或处理样品去掉不溶物质。应尽量用小体积的样品。
    有些样品能很强地吸附在柱填料上,这样会降低塔板数,改变样品的保留时间、峰形,并且使得基线变差。除了用预处理的方法除去强保留物质外,还要加保护柱,定期清洗色谱柱。有时因为疏忽,用对柱有害的溶剂溶解样品,比如用6mol/L的氢氧化钠溶解样品,这样的样品只要进50~100μL到硅胶基质柱中,硅胶就很快溶解而使柱报废。在这种情况下,应立即中和样品,或除去原溶剂中的有害成分。

5.用强溶剂定期冲洗柱
    每次工作结束,用强溶剂冲洗柱是良好的习惯。可用甲醇、乙腈冲反相柱,冲去留在柱上的强吸附组分。用甲醇/水为流动相时也应冲洗。冲洗的程序在以下章节中介绍。
    柱头的烧结不锈钢滤片,要求平整,死体积小,孔径适当(2~5μm)。过滤片选择不好会改变色谱峰形,增加阻力或起不到阻挡污染物的作用(填料很快变色)。

    此外,对柱硬件的保养也不可忽视。实际操作中应注意以下几点:
1、 接头要配套,用同一厂商的组接件;
2 、接头之间、柱压帽螺母与密封卡磁之间无微粒(填料),否则收紧时容易咬死;
3 、密封卡套与柱管一次性卡紧后再也不能松动,所以拆开柱头再上紧时要小心,不能使卡套移动,原来柱端的不锈钢滤片和垫片的厚度和强度也不能改变(改变这些附件的性能就促使卡套移动);
4 、接头等组接件不要拧得过紧,适当上紧后接上泵试验,分步拧紧,直到不漏为止。还有非常重要的是柱硬件的损坏往往会造成不可挽回的损失。

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