体外循环中磷酸肌酸对未成熟心肌的保护作用

    摘要：目的研究人未成熟心肌在心肌停跳条件下高能化合物耗竭情况及磷酸肌酸(CP)对于未成熟心肌能量代谢的影响.方法先心病患儿18例按体质量、性别、年龄相近似配成9对，对每组中两个个体随机分配给两种处理，Ⅰ组为本院使用的改良停搏液，Ⅱ组改良停搏液加磷酸肌酸10mL.L-1，分别于心肌缺血前后取右心耳心肌组织HPLC测定心肌能量物质CP，ATP，ADP及AMP.结果两组术前LA，CK-MB水平无显著差异，而比较缺血未复灌10，30，50min发现Ⅱ组LA，CK-MB漏出量均较少(P＜0.05).两组术前心肌各能量物质(ATP，ADP，AMP，CP)水平相似；在缺血再灌注后心肌各能量物质(ATP，ADP，AMP，CP)Ⅱ组ATP，AMP，CP含量均明显高于Ⅰ组，ATP（0.1983mmol.g-1，0.1036mmol.g-1，P=0.008），AMP(0.1082mmol.g-1，0.0572mmol.g-1，P=0.011)，CP(0.4974mmol.g-1，0.3743mmol.g-1，P=0.005)总非扩散核苷酸TNN.（除IMP）（0.4609mmol.g-1，0.2904mmol.g-1）的恢复均优于Ⅰ组，但是两组ADP（0.1598mmol.g-1，0.1296mmol.g-1，P=0.345）无差异.Ⅱ组超微结构明显优于Ⅰ组.结论目前心肌保护条件下加入CP对于未成熟心肌能量物质保存有一定意义，即通过减少高能磷酸耗竭，增加ATP恢复和磷酸肌酸的水平，从而有利于心肌停跳过程中高能磷酸盐的保存．外源性CP有利于未成熟心肌保护。

    引言

　　我们选择部分相对单纯的婴幼儿先心病(CHD)患儿，通过心肌酶谱，乳酸代谢，能量物质的改变及心脏超微结构观察，就未成熟心肌能量物质代谢特点，磷酸肌酸对未成熟心肌保护作用进行评价。

　　1、对象和方法

　　1.1对象本组均为小于2岁CHD患儿，共18(男12，女6)例，年龄2mo～2岁（11.8±7.6）mo，体质量3.4～13kg（平均9.7±3.0）kg，病种为室间隔缺损（VSD）伴肺动脉高压（PH）18例患儿按体质量，性别，年龄相近似配成9对，对每组中两个个体随机分配给两种处理，Ⅰ组为本院使用的改良停搏液，Ⅱ组改良停搏液加磷酸肌酸10mL.L-1.两组主动脉阻断时间分别为(29.4±16.7)min及(31.7±18.6)min，体外循环时间为(61.7±26.2)min和(64.5±3.0)min，两组间的病情和手术方式、缺血时间比较P＞0.05.乳酸试剂盒(美国Abbott公司，编号：66-6293/RI)磷酸激酶试剂盒(美国Behringlnc，编号：33152-0672)，体外循环前，升主动脉钳即将开放前，开放后10，30，50min收集血液标本1～2mL，编号.3000r.min-1离心10min，取上清800μL，低温冰箱（-20℃）保存待测。

　　1.2方法LA采用荧光偏振免疫分析方法，由Abbott公司TDXFPIA(荧光偏振免疫分析仪，编号：18433-94)测定；CK-MB采用荧光免疫分析方法，由AmericanDade公司StratusFIA(荧光免疫分析仪，编号：73669)；ATP，ADP，AMP，CP采用HPLC测定.每组随机选送2例取右心耳心肌组织，戊二醛中固定常规包埋，切片，用JEM-2000EM透射电镜观察。

　　统计学处理：所有数据用美国统计软件SPSS7.5统计，用均数±标准差（X±s）表示，用配对t检验作比较。

　　2、结果

　　2．1LA，CK-MB漏出量的变化两组术前LA，CK-MB水平无显著差异(P=0.47)，而比较缺血未复灌10，30，50min发现CP组LA，CK-MB漏出量均较少(P＜0.05，Tab1).CK-MB各时间点配对t检验：t=5.986，P=0.009.LA各时间点配对t检验：t=5.589，P=0.011。

　　表1LA，CK-MB漏出量

　　Tab1LeakageofLAandCK-MB(X±s，mmol.g-1)

　　ItemGroupPreoperationIschemiat(reperfusion)/min

　　103050

　　LAControl0.9±0.54.2±1.2

　　3.8±1.0

　　3.6±1.1

　　2.6±0.9

　　CP0.9±0.33.2±1.0a3.0±1.5a1.8±1.2a1.5±0.9

　　CK-MBControl1.2±0.821.3±9.844.6±23.255.4±15.376.6±27.3

　　CP0.8±0.712.8±7.5b27.7±17.0b36.6±27.5b45.8±13.4

　　aP<0.05，bP<0.01vscontrol.

　　2.2心肌术前ATP，ADP，AMP，CP的变化两组术前心肌各能量物质(ATP，ADP，AMP，CP)变化无显著差异(Tab2)。

　　表2术前心肌ATP，ADP，AMP和CP

　　Tab2Valuesofadeninenucleotidepreoperation(n=18，X±s，mmol.g-1)

　　GroupATPADPAMPCP

　　CP0.312±0.0820.192±0.0740.052±0.0080.408±0.138

　　Control0.290±0.0420.202±0.0410.042±0.0130.415±0.046

　　2.3缺血再灌注后心肌ATP，ADP，AMP，CP变化缺血再灌注后心肌各能量物质(ATP，ADP，AMP，CP)，CP组中ATP，ADP，AMP，CP含量均明显高于对照组(P<0.01)；CP组各能量物质的恢复ATP，AMP，CP，总非扩散核苷酸TNN。（除IMP）均优于对照组(P<0.05)，但是两组ADP无差异(Tab3)。

　　2.4超微结构CP组可见心肌轻度肿胀，肌纤维排裂尚可，线粒体肿大，嵴排列较整齐，无明显断裂；对照组心肌肿胀，肌纤维结构紊素乱，Z，M，H带消失，线粒体嵴断裂，消失，偶有空泡形成，核膜不连续，染色质边集(Fig1，2)。

　　表3缺血再灌注两组心肌各能量物质变化和恢复率

　　Tab3High-energyphosphatemetabolismandrecoveryrate(n=18，X±s，mmol.g-1)

　　GroupATPADPAMPCPTNN.

　　CPPreischemia0.31±0.08

　　0.19±0.07

　　0.05±0.01

　　0.41±0.140.56±0.12

　　Postischamia0.20±0.11b0.16±0.090.11±0.10a0.50±0.30b0.46±0.34

　　Recoveryrate0.640.832.101.220.83

　　ControlPreischemia0.29±0.040.20±0.040.04±0.010.42±0.050.53±0.09

　　Postischamia0.10±0.090.13±0.070.06±0.020.37±0.27[〗0.29±0.19

　　Recoveryrate0.360.651.210.900.53

　　aP<0.05，bP<0.01vscontrol.

　　3、讨论

　　心脏直视手术冠脉血运阻断后，心肌组织由于缺血导致了心肌高能磷酸键快速消耗，继而产生生物化学，形态等一系列改变，是早年术后并发症较多、疗效不佳的重要原因.能否减少心肌细胞内能量储备的耗竭是手术的成功的关键之一.目前应用最为广泛的低温心麻痹液冠脉灌注即是出于此目的：即用含高钾溶液诱导舒张期快速而完全的停止心电活动，同时和低温减少能量利用，从而维持细胞内ATP和CP水平，为复苏保存能量基础。

　　随着心脏手术趋于幼龄化，对临床上广泛使用含钾晶体心停搏液，心肌保护效果，尚有争议。近年的一系列研究证明：虽然未成熟心肌无氧酵解能力强，耐受单纯缺氧能力较强，但对缺血的耐受性尚无统一意见。而且，从动物实验和临床研究也提示目前未成熟心肌保护措施仍然使心肌术后结构，功能损伤较重。心肌缺血的过程是一个缺氧，缺能量底物引起能量代谢改变的过程。因此单纯从能量底物的补充可能无法达到预期的效果.磷酸肌酸（CP）做为高能磷酸酸化合物可以直接为心肌供能，而不受缺氧的限制.肌酸来源丰富，而且在心肌细胞中肌酸几乎全部以离子活性状态存在，极易再磷酸化形成CP.因此CP恢复率优于术后ATP恢复.国外研究表明在心肌代谢窘迫时，加入外源性CP将在维持细胞膜电位，维持细胞内ATP，减少缺血时细胞钙负荷，维持细胞膜的稳定发挥保护作用，以抵消心脏缺血的生化改变.由于未成熟心肌细胞膜结构的特点，未成熟心肌细胞膜通透性较高，同时心肌缺血破坏心肌细胞膜结构的完整性，因此外源性CP更易通过未成熟心肌细胞膜.因此，本研究通过加强心肌停搏液中能量物质（CP），以期达到较理想的保护效果.由于临床病种，病情不一，术者、术中情况、施行的手术方式、灌注方式的不同，单纯从临床上难以灵敏、客观比较心肌保护效果的好坏.而且心脏手术中对心肌生理影响最大就是缺血引起的高能磷酸酸化合物的耗竭，并由此引发一系列生化改变。因此通过HPLC测定缺血前、后，心肌内能量物质磷酸腺苷酸（ATP，ADP，AMP）、磷酸肌酸（CP），可以反映缺血引起的高能磷酸酸化合物的耗竭程度，同时结合心肌损伤特异指标CK-MB以及既是无氧酵解产物又能估计预后的乳酸的检测，可以较为客观地对心肌损伤作出评价.为进一步揭示心肌缺血对未成熟心肌的影响提供实验依据。

　　建立在右心耳心房肌的基础上，我们发现使用CP使未成熟心肌中高能磷酸酸化合物得到相对较好的保存，总非扩散的核苷（TNundefined）CP组明显高于对照组，高能磷酸盐ATP，AMP也显著高于对照组。而反映心肌损伤的磷酸肌酸激酶同工酶（CK-MB）在缺血后各时间点漏出液漏出量上看，也与能量代谢特点相对应.从乳酸代谢上看，乳酸漏出量CP也明显低于对照组.由于手术条件限制，乳酸测定标本不是从冠状诊脉窦采集，其结果可能受心外环境（脑代谢、肝和肾对乳酸清除力、术后过渡通气等）的影响.本结果表明在目前心肌保护条件下加入CP对于未成熟心肌能量物质保存有一定意义，但是外源性CP在未成熟心肌细胞内分布程度，外源性CP与缺血心肌细胞内ADP的转化率是否存在线性关系等机制尚需进一步研究。