材料与仪器
幼胚盾片
新霉素磷酸转移酶 草胺膦乙酰转移酶基因
基因枪 诱导培养基 分化培养基
新霉素磷酸转移酶 草胺膦乙酰转移酶基因
基因枪 诱导培养基 分化培养基
步骤
1. 诱导愈伤
( 1 ) 基因枪轰击后，将盾片分散转移，每个重复分到 2~3 个含诱导培养基（MS9% 0.5 Dag) 的平皿中，大约 10 个盾片一皿（见注 48)。
( 2 ) 用封口膜封好平皿，放在 22℃ 黑暗培养诱导愈伤 [见注 4 9 和注 50 ，图 4.1(c) ]。
2. 分化和选择
( 1 ) 在诱导培养基上生长 3~5 周后，将含有体细胞胚的愈伤组织转移到含有分化培养基（RZDCu) 的 9 cm 培养皿中，22℃ 光照培养 3~4 周（见注 49 和注 51)。
( 2 ) 在分化培养基上生长 3~4 周后，将愈伤组织转移到含有 RZ+ 选择培养基的 9 cm 高盖培养皿上（见注 52 和注 53 ) [根据转化的质粒所带的选择标记基因选择适合的选择培养基：草胺膦乙酰转移酶基因（bar ) 使用RZPPT4 ; 新霉素磷酸转移酶(nptll) 基因使用 RZG50 (见注 11 和注 12)]。用封口膜封好平皿，放在 22°C 光照培养(见注 49 和注 54) 。
( 3 ) 再经过 3~4 周培养后，将存活的愈伤组织转移到不含激素但有选择试剂的分化培养基（RPPT4 或 RG50 ) 上，使用 9 cm 高盖培养皿 [ 见注 53 和 注 55，图 4 .1(d ) ]。用封口膜封好平皿，放在 22℃ 光照培养（ 见注 49)。
( 4 ) 当出现分化的苗并且它能从愈伤中分开时，将它们转到不含激素但有选择试剂的分化培养基上（RPPT4 或 RG50) ，使用 GA-7 Magenta 容器，每个里面不要超过 4~6 个。放在 22℃ 光照培养（见注 49)。
3. 将转基因苗移到土中
( 1 ) 当幼苗根系形成并且叶片长到 10~15 cm 时，将苗移到土中。小心从琼脂中移出幼苗（用水洗掉根部多余的琼脂），然后将幼苗种在 8 cm2 大小的塑料盒中 [Nursery Trades，（Lea Valley) Ltd. ]。将幼苗放入高湿度的培养箱中 1~2 周，使它们适应新环境，然后放在温室中生长（见注 56 和注 57) 。从基因枪轰击后到幼苗移到土里通常需要 3 个月时间。
( 2 ) 当幼苗长到合适大小（3~4 片叶）时，取叶片提取基因组 DNA，PCR 鉴定是否是转基因植株。若 PCR 鉴定为阳性，将阳性苗移到 13 cm2 大小的塑料盒 [Nursery Trades (Lea Valley) Ltd. ] 中，同样的温室条件生长（见注 57)。植株到成熟需要 3~4 个月 [ 图 4.1 (e ) ]。
( 3 ) 分析转基因植物方法很多：使用报告基因表达分析，如 β-葡萄糖苷酶（GUS) 组织化学检测（46 ) [图 4.1 (f ) ] 、紫外条件下观察绿色荧光蛋白（GFP) 以及针对草胺膦乙酰转移酶基因 （bar) 使用除草剂涂抹叶片（47 ) 或者氨测试盒（48) 。Southern 杂交分析和荧光原位杂交（FISH) 分析基因整合。
( 1 ) 基因枪轰击后，将盾片分散转移，每个重复分到 2~3 个含诱导培养基（MS9% 0.5 Dag) 的平皿中，大约 10 个盾片一皿（见注 48)。
( 2 ) 用封口膜封好平皿，放在 22℃ 黑暗培养诱导愈伤 [见注 4 9 和注 50 ，图 4.1(c) ]。
2. 分化和选择
( 1 ) 在诱导培养基上生长 3~5 周后，将含有体细胞胚的愈伤组织转移到含有分化培养基（RZDCu) 的 9 cm 培养皿中，22℃ 光照培养 3~4 周（见注 49 和注 51)。
( 2 ) 在分化培养基上生长 3~4 周后，将愈伤组织转移到含有 RZ+ 选择培养基的 9 cm 高盖培养皿上（见注 52 和注 53 ) [根据转化的质粒所带的选择标记基因选择适合的选择培养基：草胺膦乙酰转移酶基因（bar ) 使用RZPPT4 ; 新霉素磷酸转移酶(nptll) 基因使用 RZG50 (见注 11 和注 12)]。用封口膜封好平皿，放在 22°C 光照培养(见注 49 和注 54) 。
( 3 ) 再经过 3~4 周培养后，将存活的愈伤组织转移到不含激素但有选择试剂的分化培养基（RPPT4 或 RG50 ) 上，使用 9 cm 高盖培养皿 [ 见注 53 和 注 55，图 4 .1(d ) ]。用封口膜封好平皿，放在 22℃ 光照培养（ 见注 49)。
( 4 ) 当出现分化的苗并且它能从愈伤中分开时，将它们转到不含激素但有选择试剂的分化培养基上（RPPT4 或 RG50) ，使用 GA-7 Magenta 容器，每个里面不要超过 4~6 个。放在 22℃ 光照培养（见注 49)。
3. 将转基因苗移到土中
( 1 ) 当幼苗根系形成并且叶片长到 10~15 cm 时，将苗移到土中。小心从琼脂中移出幼苗（用水洗掉根部多余的琼脂），然后将幼苗种在 8 cm2 大小的塑料盒中 [Nursery Trades，（Lea Valley) Ltd. ]。将幼苗放入高湿度的培养箱中 1~2 周，使它们适应新环境，然后放在温室中生长（见注 56 和注 57) 。从基因枪轰击后到幼苗移到土里通常需要 3 个月时间。
( 2 ) 当幼苗长到合适大小（3~4 片叶）时，取叶片提取基因组 DNA，PCR 鉴定是否是转基因植株。若 PCR 鉴定为阳性，将阳性苗移到 13 cm2 大小的塑料盒 [Nursery Trades (Lea Valley) Ltd. ] 中，同样的温室条件生长（见注 57)。植株到成熟需要 3~4 个月 [ 图 4.1 (e ) ]。
( 3 ) 分析转基因植物方法很多：使用报告基因表达分析，如 β-葡萄糖苷酶（GUS) 组织化学检测（46 ) [图 4.1 (f ) ] 、紫外条件下观察绿色荧光蛋白（GFP) 以及针对草胺膦乙酰转移酶基因 （bar) 使用除草剂涂抹叶片（47 ) 或者氨测试盒（48) 。Southern 杂交分析和荧光原位杂交（FISH) 分析基因整合。
来源：丁香实验
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