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高效液相色谱法测定生物样本中头孢噻肟和舒巴坦的浓度

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【Abstract】 AIM: To establish a determination method of concentrations in human biologic sample following intravenous administration of cefotaxime and sulbactam. METHODS: A RPHPLC method was developed and validated to determine cefotaxime and sulbactam in plasma and urine. The mobile phase of cefotaxime and sulbactam consisted of 1 g/L triethylamine (regulated with phosphate acid to pH=6.2) and methanol in a 68∶32 and 84∶16 (v/v) respectively and pumped at a flow rate of 1 mL/min. The plasma samples were deproteinated by addition of methanol, the urine samples were diluted with super pure water, then 20 μL of supernatant was injected onto a C18 column and monitored with UV detector at 254 nm and 220 nm respectively. RESULTS: The assay of cefotaxime in human plasma and urine were linear over the range of 5.3-530.0 mg/L and 5.45-545.00 mg/L respectively, with the detection limit of 1 mg/L and 0.25 mg/L respectively. The assay of sulbactam in human plasma and urine were linear over the range of 1.04-208.00 mg/L, with the detection limit of 0.50 mg/L and 0.25 mg/L respectively. The average recovery of the method was (89-110)%, and the RSD within and between days were all less than 5%. The cefotaxime and sulbactam sample of plasma and urine stored in a -20℃ refrigerator became stable within 3 d. CONCLUSION: The assay method is rapid, accurate and usable for the determination of cefotaxime and sulbactam concentrations in plasma and urine.
 
  【Keywords】  cefotaxime; sulbactam; chromatography, high pressure liquid; plasma; urine

  【摘要】 目的: 为静滴注射用头孢噻肟钠舒巴坦钠后在血浆和尿液中的药物浓度分析提供检测方法. 方法: 采用HPLC测定头孢噻肟钠血浆和尿液中浓度. 在血样中加入甲醇沉淀蛋白后,尿样用超纯水稀释后取上清液进样,色谱分析条件: 以C18反相柱作分析柱;柱温:室温;流速: 1 mL/min;头孢噻肟和舒巴坦的流动相分别为:1g/L的三乙胺水溶液(用磷酸调pH值6.2)∶甲醇=68∶32和84∶16;头孢噻肟和舒巴坦的紫外检测波长分别为254 nm和220 nm. 结果: 头孢噻肟血样和尿样的线性范围分别为5.3~530.0 mg/L和5.45~545.00 mg/L,最低检测浓度分别为1.00 mg/L和0.25 mg/L;舒巴坦血样和尿样的线性范围为1.04~208.00 mg/L,最低检出浓度分别为0.5 mg/L和0.25 mg/L;方法平均提取回收率在 (89~110)%之间;日内、日间RSD均小于5%. 头孢噻肟和舒巴坦血浆和尿液样品置于-20℃冰箱3 d内稳定. 结论: 本方法具有快速、简便、灵敏、准确等特点,适合于头孢噻肟和舒巴坦血浆和尿液浓度测定.
 
  【关键词】 头孢噻肟;舒巴克坦;色谱法,高压液相;血浆;尿

  0引言

  由湘北威尔曼制药有限公司开发研制的一类复方新药注射用头孢噻肟钠舒巴坦钠已经国家食品药品监督管理局批准进行Ⅰ期临床试验(临床研究批件号:2005L00727). 头孢噻肟钠属第三代半合成头孢菌素类,其抗菌谱广,对革兰阴性菌、革兰阳性菌、需氧菌和某些厌氧菌均有较好的抗菌活性,特别对革兰阴性菌的杀灭作用更强. 随着头孢噻肟在临床的广泛使用,许多临床病原菌通过产生β内酰胺酶对头孢噻肟产生耐药性而导致临床治疗方案的失败[1-2]. 舒巴坦为半合成β内酰胺酶抑制剂,与头孢噻肟合用时出现协同作用,使对头孢噻肟耐药的细菌的最低抑菌浓度下降到敏感范围之内. 为了评价静滴注射用头孢噻肟钠舒巴坦钠后该药品在健康志愿受试者的耐受性以及药代动力学特点,我们采用高效液相色谱法测定了生物样本中头孢噻肟和舒巴坦的浓度.

  1材料和方法

  1.1材料Beckman公司System gold高效液相色谱仪(125型二元梯度泵,7725i手动进样器,20 μL定量环,168型紫外检测器,32 Karat TM Software).   头孢噻肟、舒巴坦对照品(中国药品生物制品检定所),甲醇为色谱纯(迪马公司),水为自制超纯水,其余试剂均为分析纯.
 
  1.2方法

  1.2.1色谱条件色谱柱: 迪马公司 Diamonsil  C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm);柱温: 室温;流速: 1 mL/min;进样量: 20 μL. 头孢噻肟流动相: 1 g/L的三乙胺水溶液(用磷酸调pH值6.2)∶甲醇=68∶32;头孢噻肟紫外检测波长: 254 nm. 舒巴坦流动相: 1 g/L的三乙胺水溶液(用磷酸调pH至6.2)∶甲醇=84∶16;舒巴坦紫外检测波长: 220 nm.
 
  1.2.2样品处理血样处理: 精密量取血浆0.2 mL,置1.5 mL尖底离心管中,加入甲醇0.5 mL,漩涡混合0.5 min,离心(4200 g)20 min,取上清液20 μL进样. 尿样处理: 将尿液用水稀释10~200倍后,漩涡混合0.5 min,用0.45 μm微孔滤膜滤过,取20 μL进样.

  2结果

  2.1色谱图头孢噻肟对照品溶液、空白血浆、健康受试者给药后的血浆样品的色谱(图1),空白尿液、给药后的尿液样品的色谱(图2),其中头孢噻肟保留时间约为5.8 min;舒巴坦对照品溶液、空白血浆、健康受试者给药后的血浆样品的色谱(图3),空白尿液、给药后的尿液样品的色谱(图4),其中舒巴坦保留时间约为4.5 min. 结果表明,空白血浆、空白尿液中杂质不干扰测定.

  图1头孢噻肟(1)对照品溶液(A),空白血浆(B),健康受试者给药6 h后的血浆样品(C)的色谱图(略)

  图2头孢噻肟(1)空白尿液样品(A),健康受试者给药4 h后的尿液样品(B)的色谱图(略)

  图3舒巴坦(1)对照品溶液(A),空白血浆(B),健康受试者给药2 h后的血浆样品(C)的色谱图(略)

  图4舒巴坦(1)空白尿液样品(A),健康受试者给药2 h后的尿液样品(B)的色谱图(略)

  2.2标准曲线

  2.2.1头孢噻肟标准曲线方程取空白血浆0.2 mL,加入适量对照品溶液,使血浆中头孢噻肟浓度依次分别为5.3, 10.6, 53, 106, 212, 318, 424和530 mg/L,按照血浆样品制备方法制备,在上述色谱条件下,进样20 μL,测定对照品峰面积. 以色谱峰面积(A)对头孢噻肟浓度C(mg/L)作加权线性回归(权重为1/C2),求得线性方程为A=8770.487C+10391.277, R2=0.9994. 线性范围为5.3~530.0 mg/L(n=8). 血浆中头孢噻肟的最低检出浓度(按信噪比≥3计)为1 mg/L. 尿样中头孢噻肟色谱峰面积(A)对浓度C(mg/L)作加权线性回归(权重为1/C2),求得线性方程为A=37055.42C+78893.03, R2=0.9998. 线性范围为5.45~545 mg/L(n=8),尿样中头孢噻肟的最低检出浓度(按信噪比≥3计)为0.25 mg/L.
 
  2.2.2舒巴坦标准曲线方程取空白血浆0.2 mL,加入适量舒巴坦对照品溶液,使血浆中舒巴坦浓度依次分别为1.04, 2.08, 5.20, 10.4, 52, 104和208 mg/L,按照血浆样品制备方法制备,在上色谱条件下,进样20 μL,测定对照品峰面积. 以色谱峰面积(A)对舒巴坦浓度C(mg/L)作加权线性回归(权重为1/C2,图4),求得线性方程为A=1681.319C+779.655, R2=0.9996. 线性范围为1.04~208 mg/L(n=7). 血浆中舒巴坦的最低检出浓度(按信噪比≥3计)为0.5 mg/L. 以尿样中舒巴坦色谱峰面积(A)对浓度C(mg/L)作加权线性回归(权重为1/C2),求得线性方程为A=5415.424C+1753.765, R2=0.9994,线性范围为1.04~208 mg/L(n=7). 尿样中舒巴坦的最低检出浓度(按信噪比≥3计)为0.25 mg/L.
 
  2.3提取回收率分别用甲醇配制头孢噻肟对照品溶液和舒巴坦对照品溶液,同时制备相同浓度的血样和尿样并依法处理,分别进样分析,以血样和尿样中药物峰面积与对照品峰面积比值计算提取回收率(表1).

  表1血样和尿样中头孢噻肟和舒巴坦提取回收率(略)

  2.4方法精密度

  2.4.1头孢噻肟方法精密度取空白血浆加入适量头孢噻肟对照品,配制成低、中、高浓度分别为10, 100和400 mg/L血浆样品,在1 d内按样品测定法重复测定6次,求得日内RSD分别为2.74%, 2.21%和3.40%. 将上述3个浓度的样品在3 d内连续各重复测定6次,求得日间RSD分别为3.13%, 2.85%和3.85%.
2.4.2尿液中头孢噻肟方法精密度取空白尿液加入适量头孢噻肟对照品,配制成低、中、高浓度分别为10, 100和400 mg/L尿液样品,在1 d内按样品测定法重复测定6次,求得日内RSD分别为1.52%, 1.30%和1.14%. 将上述3个浓度的样品在3d内连续各重复测定6次,求得日间RSD分别为1.44%, 1.78%和1.30%.
 
  2.4.3血浆中舒巴坦方法精密度取空白血浆加入适量舒巴坦对照品,配制成低、中、高浓度分别为2.08, 10.4和104 mg/L血浆样品,在1 d内按样品测定法重复测定6次,求得日内RSD分别为3.59%, 2.43%和1.75%. 将上述3个浓度的样品在3d内连续各重复测定6次,求得日间RSD分别为3.20%, 2.80%和2.06%.
 
  2.4.4尿液中舒巴坦方法精密度取空白尿液加入适量舒巴坦对照品,配制成低、中、高浓度分别为2.08, 10.4和104 mg/L尿液样品,在1 d内按样品测定法重复测定6次,求得日内RSD分别为1.46%, 1.09%和0.48%. 将上述3个浓度的样品在3 d内连续各重复测定6次,求得日间RSD分别为1.63%, 1.37%和1.06%.
 
  2.5样品稳定性试验
  2.5.1头孢噻肟血浆和尿液样品-20℃放置稳定性试验将低、中、高(10.6, 106和424 mg/L)3个浓度的头孢噻肟血浆样品和尿液样品分别置于-20℃冰箱内1, 2, 3 d;另将低、中、高(10.9, 109和436 mg/L)3个浓度的头孢噻肟尿液样品同法放置,按前述方法测定头孢噻肟浓度变化,血浆中RSD分别为2.51%, 1.46%和2.41%,尿液中RSD分别为0.52%, 2.39%和1.70%. 表明头孢噻肟血浆和尿液样品置于-20℃冰箱3 d内稳定.
 
  2.5.2舒巴坦血浆和尿液样品-20℃放置稳定性试验将低、中、高(2.08, 10.4和104 mg/L)3个浓度的舒巴坦血浆样品和尿液样品分别置于-20℃冰箱内1, 2, 3d;另将低、中、高(2.08, 10.4和104 mg/L)3个浓度的舒巴坦尿液样品同法放置,按前述方法测定舒巴坦浓度变化,血浆中RSD分别为10.33%, 4.73%和8.80%,尿液中RSD分别为0.67%, 0.66%和0.76%. 表明舒巴坦血浆和尿液样品置于-20℃冰箱3 d内稳定.

  3讨论

  我们采用HPLC法测定生物样本中头孢噻肟和舒巴坦浓度,同文献报道的紫外法[3]、微生物法[4-5]和HPLC法[6-7]相比较,样品预处理简单,测定时间短,方法准确精密,稳定性高,适合药代动力学和临床药物浓度监测应用.
 
  血样处理方法可采用三氯醋酸、高氯酸做蛋白沉淀剂,蛋白沉淀完全,但酸性强,头孢噻肟和舒巴坦分子中含有酯基、酰胺基等结构,溶液中的酸能催化这些基团的水解,经试用这些方法样品中头孢噻肟和舒巴坦均表现不稳定,含量大幅降低. 采用甲醇直接沉淀蛋白, 沉淀离心后直接取上清液测定,使样品处理步骤大大简化,效果良好,回收率高.
 
  流动相未采用易形成结晶的缓冲盐溶液和价格较贵的离子对试剂,而选用甲醇1 g/L三乙胺水溶液的流动相体系,所用试剂价廉低毒, 加入1 g/L三乙胺的目的是掩盖固定相表面游离硅醇基的活性,减少了头孢噻肟和舒巴坦的化学结构中酰胺基团与固定相表面游离的硅醇基发生的相互作用,头孢噻肟和舒巴坦的色谱峰形均较好. 经试验甲醇与1 g/L三乙胺水溶液比例分别为68∶32及84∶16时,头孢噻肟和舒巴坦的保留时间分别为5.8 min和4.5 min,保留时间长短适宜于生物样本的大规模分析的需要.
 
  流动相中水相的pH值在4~7范围内时,舒巴坦保留时间变化不大,而头孢噻肟保留时间则随pH升高而延长,在pH6.2左右时各峰保留时间合适,且峰型较好,无明显拖尾,故以pH6.2±0.1作为水相的pH值,实际效果理想.
 
  紫外扫描测得头孢噻肟的最大吸收波长为240 nm, 但254 nm处吸收也较高,并且254 nm处干扰更少,故选254 nm为检测波长. 舒巴坦最大吸收波长为210 nm,但系末端吸收,干扰较大,选择220 nm为检测波长较适宜.

  【参考文献】

  [1] 耿燕,张王刚,王香玲,等. 泌尿系感染产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌的耐药表型和基因分型[J]. 第四军医大学学报,2005,26(7):622-624.

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  [4] Casal J, Aguilar L, Jado I, et al. Effects of Specific Antibodies against Streptococcus pneumoniae on Pharmacodynamic Parameters of βLactams in a Mouse Sepsis Model[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2002,46(5):1340-1344.

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  [6] 曲福军,于景翠,孙华,等. 阿莫西林舒巴坦酯片人体药代动力学及相对生物利用度研究[J].中国药房,2003,14(4):225-227.

  [7] 林彩,刘松青,代青,等. HPLC测定烧伤患者肾脏透析排出液中头孢噻肟钠的含量[J].华西药学杂志,2003,18(1):60-61.

 

 

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