高效液相色谱柱后衍生测定鸡组织中甲基盐霉素残留量

　　【摘要】  建立了鸡组织中甲基盐霉素的高效液相色谱柱后衍生化分析方法。样品经异辛烷提取，离心后上层有机相过硅胶固相萃取小柱，洗脱液浓缩后用V(甲醇)∶V(水)=90∶10混合液溶解。采用Inertsil ODS�3 C18柱，以V(甲醇): V(乙酸)∶V(水)=94∶3∶3为流动相，香草醛为衍生剂进行高效液相色谱柱后衍生分析，520 nm检测，外标法定量。方法检出限为6 μg/kg; 定量限为20 μg/kg; 添加浓度在20~1800 μg/kg范围内，平均添加回收率为76�4%~93�1%; 批内相对标准偏差(RSD)在2�6%~8�9%之间; 批间相对标准偏差(RSD)在4�7%~9�7%之间。样品浓度在０．０7~10．0 mg/L范围内与峰面积呈良好的线性关系，r>0�9993。

　　【关键词】  鸡组织，固相萃取，甲基盐霉素，柱后衍生，残留

　　Determination of Narasin in Chicken Tissues by High Performance　Liquid Chromatography with Post�column Derivatization

　　WU Yin�Liang, WANG Li�Jun, YANG Ting, ZHAO Jian, HUANGFU Wei�Guo

　　(The Supervision, Inspection & Testing Center Of Agricultural Products Quality ＆ Security，Ministry of Agriculture, Ningbo 315040)

　　Abstract  A method was developed for determining residual narasin in chicken tissues by HPLC with post�column derivatization. The samples were extracted with iso�octane. Further cleanup was performed on LC�si cartridge after centrifugation. Then the eluent was dried by nitrogen and residues were dissolved in methanol, water mixture (90∶10 v/v). The samples were analyzed on an Inertsil ODS�3 C18 column with a mixture of methanol�acetic acid�water as the mobile phase and vanillin as the derivatization reagent. The detection wavelength was 520 nm. The samples were quantified with the external standard calibration curve method. The limit of detection and the limit of quantification for narasin in chicken tissues were 6�0 μg/kg and 20 μg/kg, respectively. The average recoveries of narasin in chicken tissues were 76�4 %－93�1 %, the intra�assay relative standard deviations were 2�6 %－8�9% and the inter�assay relative standard deviations were 4�7%－9�7% at spiked levels of 20－1800 μg/kg. There was a good linear correlation (the calibration coefficient is above 0�9993) between the peak areas and concentration of narasin in the range of 70－10000 μg/L.

　　Keywords  Chicken tissues, solid phase extraction, narasin, post�column derivatization, residue

　　1  引 言

　　甲基盐霉素(narasin)是金色链霉菌（streptomyces aureofaciens）的发酵产物，属于聚醚类抗生素，常作为药物添加剂混料饲喂来预防鸡球虫病[1]。但是这种用药方式易导致动物性食品中药物残留和球虫出现抗药性[2]，从而影响畜禽产品的质量安全和动物生产。我国已制定了甲基盐霉素在鸡组织中的最高残留限量，其中鸡肌肉、鸡皮/脂肪和鸡肝中最高残留限量分别为600、1200和1800 μg/kg。因此，有必要建立鸡组织中甲基盐霉素残留分析方法。

　　对莫能菌素和盐霉素这两种聚醚类抗生素的残留分析主要采用柱前衍生HPLC法[3]和柱后HPLC法[4~6]；而甲基盐霉素的残留量分析主要采用时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）[7,8]、柱后HPLC法[9~11]、LC/MS法[12,13]和LC/MS/MS法[14~16]，涉及的对象有饲料、鸡肉、鸡内脏、鸡蛋和鱼组织等[7~16]。本实验根据甲基盐霉素的化学性质建立了柱后衍生分析方法，采用异辛烷为提取剂，步骤相对简单，提取液可直接过固相萃取小柱。本方法灵敏度高、准确且稳定。

　　2 实验部分

　　2�1 仪器与试剂

　　2690�996高效液相色谱仪，配柱后衍生装置和二极管阵列检测器（Waters公司）；Inertsil ODS�3 C18色谱柱(25 cm×4�6 mm，5μm)；离心机（Sigma公司）；Ultra�Tyrrax T25型匀质器（德国）；硅胶SPE小柱（500 mg，3 mL）。甲基盐霉素标准品（Sigma 公司）。香草醛（Fluka公司）；衍生液配制：量取5 mL H2SO4，缓慢加入到250 mL甲醇中，置冰水浴中缓慢加入20 g香草醛，混匀，脱气5 min后避光保存，临用现配；异辛烷和甲醇均为色谱纯(Fisher公司)；乙酸和浓H2SO4为分析纯（北京化学试剂公司）。

　　2�2 色谱分离条件

　　流动相：V(甲醇)∶V(乙酸)∶V(水)=94∶3∶3；流速： 0�8 mL/min；衍生液流速：0�4 mL/min；反应温度： 95 ℃；检测波长： 520 nm；进样量： 100 μL；柱温： 30 ℃。

　　2�3 样品处理

　　2�3�1 样品中甲基盐霉素的提取

　　称取组织样品(5�0±0�05）g于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入10 mL蒸馏水，以10000 r/min以上的速度均质60 s，再加入10 mL异辛烷，旋涡混合3 min左右，以3000 r/min离心5 min，吸取上层有机相,备用。然后加入10 mL异辛烷，按上述步骤重复提取一次，取上层有机相,备用，合并两次离心后的有机相。

　　2�3�2 固相萃取净化

　　用5 mL异辛烷预洗硅胶小柱，不使流干，加入2�3�1所得的上清液，然后再用5 mL异辛烷淋洗，过柱流速控制在1~2 mL/min，然后抽干小柱，再用2 mL甲醇洗脱，于40℃水浴中氮气吹干后用1�0 mL V(甲醇)∶V(水)=90∶10混合液溶解，高效液相色谱仪测定。

　　2�4 线性实验

　　称取10�0 mg甲基盐霉素于100 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得100 mg/L甲基盐霉素标准储备液。吸取标准储备液10 mL于100 mL棕色容量瓶中，得10 mg/L标准工作液。将标准工作液用流动相稀释成70、250、500、1000和5000 μg/L的标准工作溶液和10 mg/L标准工作溶液一起进行HPLC分析。每个浓度进样6次，以标准工作液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

　　2�5 添加回收率实验

　　添加回收率实验添加浓度为20、100、300和600 μg/kg（鸡肉），20、100、600和1800 μg/kg（鸡肝），20、100、300和600 μg/kg（鸡肾）及20、100、600和1200 μg/kg（鸡脂肪）。称样后加入标准溶液，涡旋混匀放置0�5 h后进行样品处理，其它步骤同2�3。

　　3 结果与讨论

　　3�1 色谱条件的建立

　　本实验色谱条件基本参照文献[4]进行分析，其中4种组织的添加浓度均为20 μg/kg，所得图谱见图1。从图1可知，甲基盐霉素出峰时间为6�56 min，峰形较好，在空白组织中未见干扰。

　　3�2 提取和净化条件的选择

　　甲醇、乙睛、丙酮、异辛烷和正已烷可用于提取聚醚类药物，但为减少后续净化的压力，通常选择极性相对较低的异辛烷、氯仿、乙酸乙酯等。本实验对异辛烷的提取条件进行了优化，发现当鸡肉中添加浓度为5000 μg/kg时，提取两次（每次10 mL）直接进样扣除空白后的回收率>95%。通常，选择正相固相萃取净化动物组织中的聚醚类药物，有氧化铝小柱和硅胶小柱。本实验在参考文献[4]的净化方法和不影响方法灵敏度的基础上，将10 mL二氯甲烷洗涤液改为5 mL异辛烷，6 mL二氯甲烷/甲醇洗脱液改为2 mL甲醇，节约了溶剂，缩短了实验时间。3�3  衍生化条件的优化

　　固定流动相流速，以4种鸡组织样品为基质，考察衍生液的流速对信噪的影响。实验发现，当衍生液流速为0�1~0�4 mL/min时，各种组织的添加样品（浓度100 μg/kg）的信噪比逐步增加；流速为0�4~0�8 mL/min时，信噪比均无明显变化。实验选择衍生液的流速为0�4 mL/min。

　　3�4 线性实验

　　根据2�4线性实验方法，在0�7~10�0 mg/L范围内，以峰面积对甲基盐霉素浓度作图，所得标准曲线方程为y=105�8x+10�5，相关系数均大于0�9993，说明本方法适用于甲基盐霉素的定量分析。

　　3�5 方法的检出限、回收率和精密度

　　采用在空白样品中添加标准溶液的方法，对4种鸡组织进行了4次添加回收率重复实验，每次每个浓度点进行5次重复实验，实验结果见表1。从表1可见，鸡组织中各浓度点平均添加回收率在76�4%~93�1%之间。批内相对标准偏差(RSD)在2�6%~8�9%之间，批间相对标准偏差(RSD)在4�7%~9�7%之间，可见本方法具有较好的准确性和稳定性。甲基盐霉素在4种鸡组织中的检出限均为6�0 μg/kg (S/N=3)，定量限均为20�0 μg/kg (S/N=10)。表1  鸡组织中甲基盐霉素的平均回收率和相对标准偏差（略）

　　3�6 方法应用

　　利用本方法对甲基盐霉素预混剂在鸡体内休药期进行了检测。休药0 h,鸡肉中含甲基盐霉素(85�2±2�6) μg/kg（n=3）;休药48 h后,鸡肉中未检出甲基盐霉素。

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