超高效液相色谱―质谱法快速分析番茄及其制品中矮壮素和缩节胺残留量

　　【摘要】  采用超高效液相色谱�串联质谱（UPLC/MS�MS）研究了番茄及其制品中矮壮素和缩节胺残留量的测定方法。样品用水提取，无需经过任何净化过程；在粒径为1.7 μm的超高压亲水作用色谱柱上以V（乙腈）∶V（含0.1%甲酸的10 mmol/L乙酸铵溶液）=6∶4为流动相，等度洗脱分离；电喷雾正离子检测（ESI+）,多反应监测模式（MRM）对定性和定量离子进行MS测定。结果表明：矮壮素和缩节胺的添加水平在5、10 和20 μg/kg时，回收率范围分别为78.5%～90.1%和80.0%～104.0%；相对标准偏差在9.5%～11.3%和 10.5%～13.2%之间；方法检出限均为0. 8 μg/kg。本方法仅需约２ min的检测时间，且灵敏、准确，完全满足番茄及其制品中矮壮素和缩节胺残留量的快速、高灵敏度的分析要求。

　　【关键词】  矮壮素和缩节胺残留 番茄及其制品 超高效液相色谱/串联质谱

　　1  引言

　　矮壮素(chlormequat) 是2�氯乙基三甲铵氯化物的商品名称，缩节胺（mepiquat）也叫助壮素，是1,1�二甲基哌啶氯化物的商品名称，二者均是高效、低毒、广谱的植物生长调节剂，使用后有利于提高植物的抗逆性，并大幅增加产量[1，2]。

　　矮壮素可通过食道引起中毒 [3]。我国制定的小麦、玉米和棉籽油中矮壮素残留的限量标准[4]分别为：5、5、0.5 mg/kg。对蔬菜、水果中没有明确的规定。欧盟规定矮壮素在梨果类水果如苹果、梨、柚等中的限量为0.05 mg/kg [5]。日本规定矮壮素在番茄中的残留限量为0.05 mg/kg。而对缩节胺在番茄中的限量没有明确规定，则归属于“一律标准”，即0.01 mg/kg[6]。

　　检测农产品中矮壮素残留的常用方法有化学法(水剂HG2�818�75)、电位滴定法(CIPAC手册,1988, D, 39)以及碱热离子检测器或高灵敏度氮磷检测器的气相色谱法[7]，定量限仅为0.1 mg/kg。Castro 等[8]通过离子肼（ion trap）为质量分析器的 LC/MS�MS检测了水果中矮壮素残留量，样品净化使用了C18固相萃取小柱；Alder和 Startin [9]采用LC/MS和LC/MS�MS将8个实验室进行的矮壮素和缩节胺残留检测的比对实验结果进行了统计，样品用V(甲醇)∶Ｖ（Ｈ２Ｏ）＝2∶1提取，但对定性离子的选择未作详细描述。色谱柱中使用小颗粒填料，极大地提高了高效液相色谱的分离能力和灵敏度。应用超高效液相色谱�串联质谱（UPLC/�MS�MS）检测的方法未见报道。

　　本实验应用Waters公司的针对强极性碱化合物的HILIC色谱柱，有效地保留和分离了番茄及其制品中该两种农药残留，以ESI+和MRM模式进行UPLC/MS�MS分析，并对方法的检出限、线性范围、样品加标回收率及精密度进行了分析测定，达到了提高这两种农药残留量测定方法的灵敏度、准确度及检测速度的目的。

　　2  实验部分

　　2.1  仪器与试剂

　　AcquityTM超高效液相色谱仪(Waters公司)；Micromass Quattro Premier XE 串联质谱(Waters公司)；电喷雾电离(ESI)接口。乙腈：HPLC级（美国Fisher公司）；乙酸铵：HPLC级（美国TEDIA公司）；甲酸：HPLC级（美国TEDIA公司）；水由Milli�Q净化系统制得。矮壮素和缩节胺标准品纯度均为（99±0.5）%（德国Labor Dr.Ehrenstorfer�Schaefers）。将这两种标准品以甲醇 (HPLC级，美国Fisher公司) 分别配制成1000 mg/L的标准储备液，置于－18℃冰箱保存。

　　2.2  色谱和质谱条件

　　AcquityTM，UPLC；BEH HILIC柱 (美国Waters公司) (1５０ mm×２．1 mm， 1.7 μm)；柱温30℃；流速: 0.25 mL/min；流动相为V（乙腈）∶V（含0.1%甲酸的10 mmol/L乙酸铵溶液）=6∶4。进样体积3 μL。 ESI+模式，毛细管电压3.5 kV；萃取电压3 V；离子源温度110℃；脱溶剂温度350℃；脱溶剂气流量400 L/h；锥孔气流量50 L/h；扫描范围50～200 m／z；光电倍增器电压 650 V；碰撞室氩气流量0.15 L/h，监测离子、碰撞能量和锥孔电压等MRM分析参数及矮壮素和缩节胺的分子结构式见表1。在确定监测离子对时，考虑到２种化合物质谱裂解规律。矮壮素属于一种脂肪胺盐，分子式为C5H13NCl2，分子量为157.04，样品进入一级质谱后，在给定的分析参数下，仅改变碰撞能量，即产生稳定的基峰[M�Cl]离子（m/z 121.87）; [M－Cl]离子作为母离子进入二级质谱发生α断裂后，接着发生氢重排及i断裂产生有显著丰度的m/z 57.86离子及62.74离子碎片，定量离子选择丰度较高的m/z 57.86。类似的质谱裂解规律同样适于环胺盐类的缩节胺的分子（其分子式为C7H16NCl，分子量为149.09），[M－Cl]离子即m/z 113.96为母离子，定量离子选择丰度较高的m/z 97.81。

　　表1  矮壮素和缩节胺的MRM分析参数（略）

　　Table 1  MRM analytical parameters for chlormequat and mepiquat

　　2.3  样品的处理

　　将样品混匀，准确称取样品5.00 g，加水定容至20 mL，以2500 r/min旋涡混匀1 min，超声波提取30 min。再以8500 r/min 离心10 min，取上清液过0.2 μm滤膜（美国Waters公司，13 mm GHP），供UPLC/MS�MS 检测。

　　3  结果与讨论

　　3.1  色谱条件的选择

　　矮壮素和缩节胺属于季胺盐类化合物，极易溶于水。对常用的C18反相色谱柱和流动相如乙腈、甲醇、10 mmol／L乙酸铵、0.1% 甲酸进行了质谱行为考察。实验发现，在一级质谱全扫描的总离子流图中，在流动相中加入10 mmol／L乙酸铵有助于消除钠盐的干扰。而0.1%甲酸有助于两种目标物[M－Cl]母离子峰的形成。在满足灵敏度的条件下，选定乙腈�含0.1%甲酸的10 mmol／L乙酸铵溶液系统作为本方法的流动相。实验结果表明，无论使用甲醇还是乙腈，当体积份数从5% 或10% 线性递增至95% 或90% 并保持时，目标分析物没有分离，但改用HILIC柱（柱填料为第二代杂化颗粒硅胶）后，当采用60 %乙腈/40% 含0.1%甲酸的10 mmol／L 乙酸铵溶液时，矮壮素和缩节胺依次流出，峰面积信号也最强，且峰形对称。图1为两种目标物在MRM 模式下的色谱分离图。

　　图1  含量均为 10.0 μg/L 矮壮素(A)和缩节胺（B）的番茄酱基质标准溶液的MRM色谱图（略）

　　Fig.1  MRM chromatograms obtained from a tomato paste matrix�matched standard containing 10.0 μg/L of chlormequat (A) and mepiquat (B)

　　3.2  标准曲线和方法检�限

　　准确称取5.0 g空白样品，按2.3节方法进行处理，获取基质溶液作为溶剂，配置两种农药标准系列溶液，浓度为1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0和50.0 μg /L，以所得响应值（峰面积）Y与浓度x进行回归分析。结果表明，线性良好。矮壮素和缩节胺的标准曲线分别为Y=81.7x－47.6 和Y=107.0x+8.2，线性相关系数r分别为0.9945和0.9987。用二次水直接配制上述浓度的标准系列溶液，矮壮素和缩节胺的线性相关系数r分别为0.9990和0.9998，同样符合实验要求。

　　方法的检出限（limit of detection，LOD)是依据基质标准溶液浓度为5.0 μg /L 时的3倍信噪比值测得的。则检测5.0 g 番茄酱样品中矮壮素和缩节胺的 LOD 均为0.8 μg/kg。

　　3.3  方法的回收率与精密度

　　在３组各6个空白番茄酱样品中，分别加入０.25、０．5和1．0 mL的100.0 μg /L 的矮壮素和缩节胺混合标准溶液，按2.3节方法进行处理测定，计算回收率和精密度。测定结果表明，两种组分平均回收率分别为78.5%～90.1%及80.0%～104.0%；6次 平行测定的相对标准偏差分别为9.5%～11.3%及10.5%～13.2%，均满足定量分析要求，结果见表2。

　　表2  回收率及精密度测定结果(n=6)（略）

　　Table 2  Ｒesults of recoveries and precisions(n=6)

　　3.4  样品分析

　　3.4.1  定性分析  样品溶液和标准溶液均按LC/MS�MS条件分别进行测定。进行样品测定时，如果检出的色谱峰的保留时间与基质标准中矮壮素和缩节胺相一致，并且所选择的对应的两对离子对的丰度比相一致，则可判定为样品中存在矮壮素和缩节胺。

　　3.4.2  定量分析  本实验采用外标法定量。为减少基质对定量测定的影响，用空白样品提取液配制基质标准工作液，绘制标准工作曲线，并严格控制进样量使所测样品中目标化合物的响应值在上述线性范围以内。应用本方法，已分别对上百份番茄和番茄酱等样品进行了矮壮素和缩节胺残留的测定，结果在多份样品中检出了两种残留组分，含量为0.010～0.500 mg/kg。表3列举4个实际样品的检测结果。

　　表3  来自不同地点的4个样品检测结果（略）

　　Table 3  Ｒesults of 4 samples from different Locations

　　上述结果表明，本方法灵敏度高、选择性好，前处理方法简单、无需净化，回收率高且稳定，线性关系、回收率和重现性等方法学指标，完全能满足欧盟、美国和日本制订的食品中矮壮素和缩节胺的限量要求。特别是分析时间很短（仅需约2 min），是一种高效、快速的适于番茄及其制品中矮壮素和缩节胺残留定性、定量分析的方法。

　　【参考文献】

　　1 Ma Kui�Ｙang（马葵阳）, Yu Fang�Ｘiang（于芳祥）. Xinjiang Agricultural Science and Technology(新疆农业科技)， 2005, 4： 14

　　2 Shen Hui （沈 慧）. Agricultural Science Technology and Information（农业科技与信息）， 2005， 7： 28

　　3 Lü Wen�Ｙuan（吕文渊）. Chinese Journal of Medical Jurisprudence(中国法医学杂志)， 2001， 3（16）： 161～162

　　4 GB 2763�2005 Maximum Ｒesidue Ｌimits for Ｐesticides in Ｆood（中华人民共和国国家标准 GB 2763�2005《食品中农药最大残留限量》）

　　5 Lin Wei�Ｘuan（林维宣）. The Compilation of Residue Limits Standards for Pesticides and Veterinary Drugs in Foodstuffs in the world(各国食品中农药兽药残留限量规定)． Ｄalian(大连): Maritime Affairs University, Dalian, Press (大连海事大学出版社), 2002： ７０１

　　6 Ge Zhi�Ｒong (葛志荣). Japanese Positive List System�Maximum Residue Limits of Agricultural Chemicals in Foods(日本肯定列表制度�食品中农业化学品残留限量 药品卷). Beijing（北京）： Standards Press of China(中国标准出版社), 2006： ２７１～２７４； ８２７～８２９； １２８２

　　7 Methods for Determination of Agricultural Chemical Residues in Foods(日本厚生劳动省 食品中农用化学品残留检测方法)， 2006： １１～１２

　　8 Castro Ｒ，Moyano Ｅ. Journal of Aoac Ｉnternational， 2001, 84 (6）： 1903～1908

　　9 Alder L, Startin J R. Journal of Aoac Ｉnternational, 2005, 88 (6): 1762～1776