UPLC（超高效液相色谱）简介

超越HPLC

随着科学技术的进步，对液相色谱技术的要求也不断提高，单从技术角度的改进已经不行。这就需要同时从科学与技术的角度出发，或者说从理论高度对液相色谱重新认识。因此，UPLC（超高效液相色谱）概念得以提出，将HPLC的极限作为自己的起点。

在1996年，Waters公司推出Alliance HPLC时的主要目标是提高液相色谱的"精度"。当时多数公司都认为HPLC技术已经发展到极致了、而同时用户对性能没有更高的需求，因此HPLC的目标应该是降低成本、走向更低的价格以获得更广泛的应用。

针对这样的观念，Waters公司提出：HPLC的技术没有到达极限，用户对HPLC有更高的要求，HPLC精度的提高对更好、更可靠的结果有极大的益处，对法规的遵从也是一个极大的促进。

站在当今世界科技前沿的液相色谱用户现在又有了新的需求。首先是改进生产力的需求，因为大量的样品需要在很短的时间内完成，例如代谢组学分析；其次是在生化样品及天然产物样品的分析中，样品的复杂性对分离能力提出了更高的要求；第三是在与MS及MS/MS等检测技术联用时，对连接的质量提出了更高的要求。简而言之，我们需要"更快地得到更好的结果"。

今天我们发现，随着科学技术的进步，对液相色谱技术的要求也不断提高，单从技术角度的改进已经不行。这就需要同时从科学与技术的角度出发，或者说从理论高度对液相色谱重新认识。因此UPLC（超高效液相色谱）概念的提出也就十分自然。简而言之，UPLC是用HPLC的极限作为自己的起点。

理论基础

早在1956年，J.J van Deemter就发表了他著名的理论：van Deemter曲线及其方程式。最早这个理论是用在气相色谱上的，但是后来出现的液相色谱上也能应用这个理论。Waters公司引入UPLC的概念就是由研究这个著名的方程式开始。

首先探讨一下这个著名的方程式。如果只关心理论塔板高度（H）与流速（线速度；u）及填料颗粒度（dp）之间的关系，就可以把该方程式作如下的简化：

其中，A项代表了颗粒度和柱床填装的优良程度；B项代表了轴向扩散；而C项则代表了传质。从不同颗粒度的曲线中我们可以看到图1所示的现象：

首先颗粒度越小柱效越高；其次每个颗粒度尺寸有自己的最佳柱效的流速；最后，更小的颗粒度使最高柱效点向更高流速（线速度）方向移动，而且有更宽的线速度范围。所以降低颗粒度不但提高柱效，同时也提高速度。使用更高的流速会受到色谱柱填料耐压及仪器耐压的限制。

反之，如果不用到最佳流速，小颗粒度填料的高柱效就无法体现。另外，更高的柱效需要更小的系统体积（死体积）、更快的检测速度等一系列条件的支持，否则小颗粒度填料的高柱效同样无法充分体现。

因此，要真正创建一个全新的分离科学领域 －UPLC，必须解决以下问题：

■ 大幅提高色谱柱的性能；第一要解决小颗粒填料的耐压问题，第二要解决小颗粒填料的装填问题，包括颗粒度的分布以及色谱柱的结构。
■高压溶剂输送单元（超过15000psi）。
■ 完善的系统整体性设计，降低整个系统的体积，特别是死体积。并解决超高压下的耐压及渗漏问题。
■ 快速自动进样器，降低进样的交叉污染。
■ 高速检测器；优化流动池以解决高速检测及扩散问题。
■ 系统控制及数据管理，解决高速数据的采集、仪器的控制问题。

新型色谱填料及装填技术

UPLC分离只有在新型的、耐压而且颗粒度分布范围很窄的1.7颗粒填料合成出来之后才有可能。色谱柱技术应该涵盖几个方面的内容：首先是填料的合成，以得到高质量的填料颗粒，包括耐高压、耐酸碱等等。其次是颗粒的筛选，选出颗粒度分布尽可能窄的填料。最后是装填技术，以保证即堵住颗粒不使其外流，又不至于引起反压的大幅升高。

Waters公司利用1999年发明的杂化颗粒技术（Hybrid Particle Technology － HPT），合成了第二代有机硅填料。它使用双（三乙氧基硅）乙烷在硅胶中形成桥式乙基基团。这样合成出来的填料在其内部有了更多的"交联"结构，其机械强度有了极为显著的提高，耐压超过了20000psi。

使用这项技术，Waters公司合成了低于2颗粒度的填料―― 1.7颗粒度的"ACQUITY UPLCTM"填料。为了得到更好的耐压能力及传质作用，还优化了该填料的孔体积及孔径。

传统色谱柱填料的装填技术受两个方面的影响，导致现有小颗粒填料色谱柱的性能及质量均不能令人满意。首先是其颗粒度分布一般较宽，例如，5颗粒度填料中会有大量的4以下及6以上的颗粒，因此，通常使用2筛板在色谱柱的出口拦截填料，阻止其外漏。

其次，如果使用低于2的筛板，筛板的反压升高很快，甚至超过了填料所产生的反压。因此，目前大多数3.5、2.5或更低颗粒度的填料还是使用2的筛板，只是在柱头装填一小段5的填料。因此现有小颗粒度填料的色谱柱与理论或理想状态相距甚远。

Waters公司的ACQUITY UPLCTM使用了更严格的筛分技术使1.7填料的分布很窄，并且使用了全新筛板（专利申请中）及其他色谱柱硬件（柱管及其连接件），在超过20000psi的压力下装填。Waters公司为此安装了一条新的色谱柱装填生产线及新的测试设备。因此，ACQUITY UPLCTM色谱柱的性能及质量有了质的飞跃。

填料的合成技术、颗粒的筛分技术、筛板及色谱柱硬件技术的提高，在更高的压力下装填色谱柱是UPLC色谱柱性能、质量保证的关键。

超高压液相色谱泵

Waters公司具备制造超高压泵的能力，UNC的Groove教授所用的超高压液相色谱泵是Waters公司为其特别制造的。除了密封、高压动力之外，超高压色谱泵主要解决的问题是超高压下溶剂的压缩性及绝热升温（Adiabatic Heating）。

ACQUITY UPLCTM装备一台独立柱塞驱动、四个溶剂切换的两元高压梯度泵，其1ml/min流速时的耐压可达15000psi，具有精确、可靠的梯度性能。新型的超高压输液泵使独特的小颗粒填料技术可以在最优化的流速下工作，以充分发挥其特点。

集成改进的真空脱气技术，使四个流动相溶剂及两个进样器洗针溶剂同时得到良好的脱气。其梯度的重现性也非常好，尽管保留时间在1min以内，其重现性却与HPLC的重现性不相上下。

自动进样器

为了降低死体积、减少交叉污染，自动进样器的设计使用了许多新技术，例如针内针样品探头（XYZZ’）、压力辅助进样等等。所谓"针内针"的XYZZ’设计，实际上就是使用液相色谱管路（PEEK材料）充当进样针以减少死体积，而"外针"是一小段硬管，用来扎破样品瓶盖。

压力辅助进样在如此小的仪器的系统体积下保证可靠、重现的进样是非常重要的措施。为了降低交叉污染，采用了一强、一弱的双溶剂的进样针清洗步骤，这两个洗针溶剂也采取了脱气措施。

高速检测器

然而，在新的色谱柱技术支持下的高压、高速UPLC对ACQUITY UPLCTM结果的检测提出了挑战。首先是速度问题，在短时间内出现如此多的色谱峰需要更快的数据采集速率相适应，至少要在10Hz以上，还需要降低样品在检测池内的驻留时间。当然同普通的HPLC检测器一样，信噪比也是新型检测器的追求目标。

尽管因需要降低扩散而不得不使用很小体积的检测池（<1），但是仍然要设法提高光能量通过及传输来降低噪音。同时必须使用更快的采样速率、非常小的时间常数值，以适应UPLC所产生的非常窄的色谱峰。

ACQUITY UPLCTM使用新型光纤引导、Teflon AF池壁的流动池；10mm的光程（与普通HPLC相同）而体积只有500nL（普通HPLC的20分之一）。光束通过光纤完全引入流动池后，利用Teflon AF的特征在池壁内全折射，不损失光能量；同时采样速率达到40点/s。

这样设计的高速检测器不但适应了UPLC高速及高分辨率的特征，而且还对UPLC灵敏度的提高有很大的帮助。

优化系统综合性能的设计

Waters ACQUITY Ultra Performance LCTM系统的整体设计优化了超低系统体积及死体积，使之能获得成功的UPLC所必须的低扩散、高速检测所带来的所有优点，同时还可以充分利用质谱电喷雾离子化接口的优点。由于这个原因，ACQUITY UPLCTM系统会是理想的质谱接口。

当连接了我们的质谱技术时，ACQUITY UPLCTM系统的解决方案可以提供更灵敏的LC/MS及LC/MS/MS分析。例如；当与Micromass?LCT PremierTM连接时，数据的质量与速度有了惊人的改进。

应用

由于超高效液相色谱（UPLC）是一个新兴的领域，Waters的ACQUITY UPLCTM系统也是刚刚出现，因此目前已发表的应用资料还很缺乏。与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。

因此首先想到的UPLC应用是代谢组学分析及其他一些生化领域。其他目前能够想到的应用领域还包括天然产物的分析。使用UPLC与Tof或Q-Tof等质谱检测器连接，会对天然产物分析，特别是中药研究领域的发展是一个极大的促进。

多数生化样品及天然产物都十分复杂，能被分离的色谱峰再多也会觉得不够。图3是多肽指纹图的HPLC与UPLC两个色谱图（紫外检测）比较。

在同样条件下，UPLC能分离的色谱峰比HPLC多出一倍还多，因此我们有可能进一步研究：保持分离度而追求更快的分析速度，在相同时间内作更多的样品，或优化分离度在同样时间内再分出更多的色谱峰。

在提到"蛋白组学"或"代谢组学"时，与没有"组"的差别从分析的角度说就是样品量极大，需要在短时间分析成千上万的样品。UPLC不损失分离度的高速度优点在这里就能充分体现。