硅胶基硝化苯硼酸亲和色谱材料的合成及应用

　　摘  要  合成了硅胶基硝化苯硼酸亲和色谱材料，首先对间氨基苯硼酸进行硝基化，制得3氨基4硝基苯硼酸功能基团，通过 γ缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷把功能基团键合到硅胶基体上，在２０．７ ＭPa压力下装成亲和色谱预柱（35 mm×4.6 mm i.d.）。用该预柱通过六通阀后接ODS分析柱（250 mm×4.6 mm i.d.），构成中心切割二维HPLC。该系统能对含有顺二羟基结构的化合物进行在线富集，实现生物复杂样品直接进样分离分析。使用该系统对尿中多种修饰核苷进行了分离分析，以pH值7.95的0.25 mol/L NH4Ac 碱性缓冲液把实际尿样（100 μＬ）中核苷保留在预柱上，生物大分子无保留通过，再切换六通阀，以pH 4.50的25 mmol/L KH2PO4酸性洗脱液把保留在预柱上的核苷洗脱，进样到下一级ODS分析柱柱头上聚焦，然后用梯度洗脱法（pH  4.50的25 mmol/L KH2PO4 缓冲液与体积比60∶40的甲醇水梯度混合构成洗脱液）完成核苷在ODS分析柱上的分离（紫外检测260 nm）， 11种目标核苷的分离分析取得了良好的定性定量结果。

　　关键词  亲和色谱，硼酸亲和色谱预柱，多维液相色谱，直接进样

　　Synthesis and Application of a Nitroboronic Acidsubstituated　Silica for Affinity Chromatography

　　Li Fanglou, Zhao Xinjie, Xu Guowang

　　（National Chromatographic Resarch & Analysis Center, Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023）

　　Abstract  A boronic acidsubstituted silica was synthesized by using a γglycidoxypropyltrimethoxysilane as the spacer arm and using a 3amino4nitrobenzeneboronic acid as the ligand. The 3amino4nitrobenzeneboronic acid was modified from maminobenzeneboronic acid. Then, boronic acidsubstituted silica was packed in a stainlesssteel column (35 mm×4.6 mm i.d.) under the pressure of 2.07 MPa as an affinity precolumn. A coupledcolumn liquid chromatographic method for the direct analysis of 11 urinary nucleosides is described. Efficient online cleanup and concentration of 11 nucleosides from urine samples were obtained by the affinity precolumn as the first column (extraction column) and an ODS column (250 mm×4.6 mm i.d.) as the second column (analytical column). The mobile phases applied consisted of 0.25 mol/L ammonium acetate (pH 7.95) on extraction column, and of 25 mmol/L potassium dihydrogen phosphate (pH 4.5) on analytical column, respectively. Determination of urinary nucleosides was performed on analytical column by using a linear gradient elution comprising 25 mmol/L potassium dihydrogen phosphate (pH 4.5) and methanolwater (60∶40, Ｖ/Ｖ) with UV detection at 260 nm. Calibration plots of 11 standard nucleosides show good RSD, good recovery and excellent linearity (r > 0.995).

　　Keywords  Ａffinity chromatography, boronic acid affinity chromatography precolumn, multidimensional high performance liquid chromatography, direct injection

　　本文系国家杰出青年基金（Ｎo.20425516）、国家科技部“９７３”项目（No.2003CB716003）及国家科技部社会公益性项目和辽宁省科学基金资助

　　1  引 言

　　亲和色谱是分离分析各类生物分子的强有力工具，硼酸类亲和色谱是其中重要的一类。在碱性条件下，硼酸基团能与顺二羟基结构作用，生成稳定的五元环络合物，酸性条件下络合被打开。这一特性赋予了硼酸类亲和色谱材料富集提取含有顺二羟基结构的各类生物分子的能力，其中苯硼酸为功能基的硼酸类亲和色谱材料应用最多，已报道的富集、纯化、分离的应用很广，典型的如各种核苷、修饰核苷、核糖核苷、寡核苷酸等的分离，核苷肽类生物分子的分离，儿茶酚类生物分子的分离，儿茶酚雌激素与其它激素的分离，某些糖类及糖蛋白的分离，及一些酶的分离等[1]。当用HPLC分析血清、血浆、尿和脑脊髓液等生物复杂流体试样中的有重要生理功能的小分子化合物时，为避免含有的蛋白质、核酸等生物大分子污染甚至堵塞色谱柱或干扰甚至完全掩蔽目标分子，必须经过预处理。常用的沉淀分离、液液萃取、固相萃取等离线预处理方法由手工操作，往往导致重现性差，回收率低等问题。

　　直接进样分离材料能够实现在线预处理，避免大分子干扰，简化分析过程和提高分析的准确度 [2]。利用硼酸类亲和色谱材料构建在线HPLC联用体系，完成在线富集含有顺二羟基结构的各类生物分子，实现生物流体试样的直接进样分析，对于硼酸类亲和色谱材料、纤维素、丙烯酰胺、硅胶、多孔玻璃、琼脂糖及右旋糖苷等都能作其支持物[1]。另外，还有共聚物作支持物的报道[3，4]。商品化的硼酸类亲和色谱材料（如AffiGel601）以丙烯酰胺或琼脂糖为支持物。除硅胶和少量共聚物外，其它的支持基体质地软，易溶涨，不适于HPLC在线分析系统。以硅胶为支持物的硼酸类亲和色谱适于高压力的HPLC系统，已见报道的有两种[5，6]。Boos等[6]把其中的一种设计成了硼酸亲和色谱预柱（本文中以下称该预柱为“对照预柱”）。本实验合成了一种新型的硅胶基硝化苯硼酸填料，装制成亲和色谱预柱，对尿中多种修饰核苷进行了分离分析，该预柱线性、重现性和回收率各项指标都优于对照预柱。

　　2  实验部分

　　2.1  试剂与仪器

　　间氨基苯硼酸、γ 缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷、LiChrosorb Si100, 5 μm硅胶、核苷标样、内标Br8G均购自Sigma (St. Louis, Mo, USA)；甲醇（HPLC级）购自Tedia (Fairfield, OH, USA)；其它药品为分析纯；实验用水经过MilliQ (Millipore, Bedford, MA, USA)系统处理。岛津HPLC系统，含三个Shimadzu LC10ATVP泵、混合器（Mixer SUS）、SPD10AVP UVVis检测器和SIL 10ADVP自动进样器，使用Shimadzu ClassVP version 6.10 软件和SCL 10AVP工作站(Kyoto, Japan) ；六通阀(Rheodyne，USA)。预柱由本实验合成填料、装制（35 mm×4.6 mm  i.d.）；分析C18柱购自大连伊利特(5 μm Hypersil ODS2, 250 mm×4.6 mm i.d.)。

　　2.2  硅胶基硝化苯硼酸填料的制备（见图１）

　　2.2.1  功能基团硝化苯硼酸的制备

　　称取1.1160 g间氨基苯硼酸，溶于24 mＬ二次蒸馏水，加入0.80 mＬ苯甲酰氯，氮气保护下振摇1 h。乙酸乙酯3次萃取，每次30 mL，合并有机层，真空抽干。产物加入冰浴中的5 mL H2SO4/HNO3（4∶1，Ｖ/Ｖ）混酸，溶解后加饱和NaOH和NaHCO3溶液至pH 3.0，冰浴，缓慢滴加。加等体积乙酸乙酯３次萃取，合并有机层，真空抽干。产物用乙醇/乙酸乙酯（ 6∶4，Ｖ/Ｖ）作流动相过硅胶柱，取第二色带，真空抽干，得3氨基4硝基苯硼酸。

　　2.2.2  支持基体硅胶环氧化

　　称取LiChrosorb Si100, 5 μm硅胶1.5 g，160℃干燥过夜，加入经分子筛干燥的四氯化碳60 mＬ，N2保护，加入γ缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷6 mＬ，搅拌加热回流24 h.反应后硅胶抽滤，依次用50 mL丙酮、二氯甲烷、乙醚冲洗，抽干[5]。

　　2.2.3  硅胶苯硼酸化

　　上面获得的环氧化硅胶加二次蒸馏水60 mL，称取400 mg 3氨基4硝基苯硼酸，加入反应液，5 mol/L氢氧化钠溶液调pH 至7.5，升温至90℃，搅拌反应24 h。产物苯硼酸化硅胶抽滤，依次用50 mL水、甲醇、二氯甲烷、乙醚冲洗，抽干[6]。

　　2.3  硅胶基硝化苯硼酸亲和预柱的制备

　　填料加入四氯化碳中，超声10 min制匀浆，氮气驱动装柱机把匀浆压入（操作压力20.7 MPa）耐压抛光卡套式不锈钢柱（柱长35 mm，内径4.6 mm）。压力稳定后，继续维持装柱压力20 min，然后停气减压，卸下柱子，加装柱头，接入液相系统，甲醇冲洗至无紫外吸收杂质，备用。

　　2.4  样品制备

　　核苷的混合标准液(MWS)包含11种核苷和内标Br8G，它们在混标中的浓度为：假尿嘧啶核苷（Pseu）1.28 mmol/L,胞嘧啶核苷（C）0.016 mmol/L, 尿嘧啶核苷（U）0.032 mmol/L, 1甲基腺苷（m1A）0.16 mmol/L, 1甲基次黄嘌呤核苷 (m1I) 0.064 mmol/L, 1甲基鸟苷 (m1G) 0.064 mmol/L, N4乙酰胞苷 (ac4C) 0.042 mmol/L, 2甲基鸟苷(m2G) 0.032 mmol/L, 腺嘌呤核苷 (A) 0.032 mmol/L, 2,2二甲基鸟苷(m22G) 0.08 mmol/L, 6甲基腺苷(m6A) 0.008 mmol/L, 8溴化鸟苷 (Br8G) 0009 mmol/L。Br8G标准溶液浓度为030 mmol/L，所有溶液和试样在 －20℃下保存。

　　实验中的尿样来自本研究组的志愿者，年龄60岁。尿样实验前室温解冻，用 5% NH3?H2O (Ｖ/Ｖ)调pH 值到80 左右，以5000 r/min离心3 min。1 mＬ尿样加 30 μＬ Br8G标样，自动进样器每次进样100 μＬ。

　　2.5  尿中核苷在线分离分析流程

　　如图2所示，构建中心切割二维HPLC系统。操作流程如下：洁净尿样用氨水调节pH值约为8.0，加入内标，通过自动进样器直接上样，由泵1提供保留缓冲液经过六通阀6~1淋洗亲和色谱柱（柱１），使得尿中目标核苷组分亲合到预柱上；尿中保留小的非目标基质成分经过亲和预柱和六通阀45流入废液排出管路。保留完毕后，六通阀切换位置，经由混合器分别来自泵2、泵3的梯度洗脱液再经过刚接通的六通阀的③④（预柱１）①②位置，将柱１上络合的尿中核苷组分洗脱下来，到达色谱分析柱，进而完成分离分析。详细的各泵缓冲液冲洗及阀切换行为见表1。表1  各泵缓冲液冲洗及阀切换行为（略）

　　2.6  本实验制备预柱线性、重现性和回收率

　　预柱线性测试时，样品取6个浓度的混标(分别含005、0.10、0.15、0.2０、0.3０和0.40 mＬ MWS，各加入30 μＬ Br8G标样，分别加水定容至1 mＬ)进样分析，由所得相对峰面积计算得出。重现性测试时，取混标 (0.40 mＬ MWS 加入30 μＬ Br8G标样，加水定容至1 mＬ)同日进样5次的相对峰面积计算。回收率测试时，分别取0.05 mＬ MWS、 0.20 mＬ MWS、 0.40 mＬ MWS混标各加入0.5 mＬ尿样中，分别加入30 μＬ Br8G标样，再加水定容至1 mＬ，进样分析，计算相对峰面积。

　　3  结果及讨论

　　3.1  尿中核苷在线分离分析

　　研究证明人尿中多种修饰核苷作为疾病标志物，在预测人体是否发生癌变方面有重要的应用。核苷含有顺二羟基结构，该结构使硼酸亲和色谱预柱作为富集预柱的中心切割二维HPLC 在快速对尿中核苷进行分离分析方面有不可替代的作用[7]。 制得的硅胶基硝化苯硼酸亲和色谱预柱，应用于两柱联用中心切割二维HPLC系统，在分离分析作为疾病标志物的尿中多种修饰核苷上取得了良好的效果，详见图3。

　　3.2  对照预柱与本实验制备预柱的性能比较

　　可以从对照预柱与本实验制备预柱的性能比较看出本实验制备的预柱的优点。实验选择同一尿样，都进样100 μＬ。两柱都处于最佳使用条件下，即除对照预柱使用时泵1缓冲液pH值选择8.50和保留能力变化导致的阀切换时间不同外，其余色谱条件都相同。

　　从图3同尺度输出的分离分析图比较可以直观看出，本实验预柱对应结果峰形好，目标组分基线分离好，核苷目标区域内出峰的数目增多，显示与干扰杂质分离程度大。测试结果显示，本发明预柱线性、重现性和回收率各项指标都优于对照预柱，详见表2。表2  对照预柱与本实验制备预柱的线性、重现性和回收率各项分析指标对比表（略）

　　其优良的特性与苯硼酸功能基团的硝化有关，硝化苯硼酸的pKa 比苯硼酸的pKa 有明显的下降，同pH值条件下硼酸的电离能力加强，亲和能力加大。硝化苯硼酸适用的pH值底线比苯硼酸的低，对照预柱保留核苷的最佳pH值为8.50，而本研究预柱在pH值7.80以上即能达到良好的保留。

　　3.3  小结

　　本实验合成了以硅胶为支持物的硝化苯硼酸亲和色谱填料，成功应用于两柱联用的中心切割二维HPLC系统。在分离分析作为疾病标志物的尿中11种修饰核苷上取得了良好的效果。制备的预柱除了以硅胶为支持物预柱都具有的耐压和不溶涨的特点外，与对照的非硝化苯硼酸预柱相比，具有保留能力强和保留适用pH宽等优点。在最优化条件下，本实验制备预柱线性、重现性和回收率各指标都优于对照预柱。

　　References

　　1  Singhal R P, Shyamali S, DeSilva M. Adv． Chromatogr., 1992, 31: 293～335

　　2  Arvidsson T, Wahlund K G, Daoud N. J． Chromatogr., 1984, 317: 213～226

　　3  Boos K S, Wilmers B, Schlimme E, Sauerbrey R. J． Chromatogr., 1988, 456: 93～104

　　4  Boos K S, Wilmers B, Sauerbrey R, Schlimme E. U.S. Patent, 4767529. 1988

　　5  Glad M, Ohlson S, Hansson L, Mansson M O, Mosbach K. J． Chromatogr., 1980, 200: 254～260

　　6  Hagemeier E, Boos K S, Schlimme E，Lechtenborger K, Kettrup A. J． Chromatogr., 1983, 268: 291～295

　　7  Zheng Yufang(郑育芳). Investigation of Diagnosis and Followup of Cancer Based on Urinary Nucleosides (基于尿中核苷对恶性肿瘤诊断及随访的研究)． Dissertation for P D(博士学位论文). Dalian Institute of Chemical Physis, Chinese Acadeemy of Science (中国科学院大连化学物理研究所). 2003

　　(中国科学院大连化学物理研究所，大连 116023)