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酸枣仁合剂的薄层鉴别及酸枣仁皂苷A的含量测定

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  【摘要】 目的:建立酸枣仁合剂的鉴别和含量测定方法。方法:采用TLC法和HPLC法。结果:TLC法鉴别酸枣仁合剂中知母、茯苓和川芎等药材;HPLC测定酸枣仁皂苷A的含量,酸枣仁皂苷A在0.55~1.1 mg/mL范围内线形关系良好(r=0.9997),平均加样回收率为100.45%,RSD为1.30%。结论:鉴别重复性好、专属性强,含量测定方法简便,准确。

  【关键词】 酸枣仁合剂;薄层色谱法;高效液相色谱法;酸枣仁皂苷A

  Identification of Suanzaoren mixture and its quantitative determination for jujuboside A

  HE Lin1, LIU Zhi�jun2, HU Xiao�bing3 (1. The Children’s Hospital of Chengdu, Sichuan Chengdu 610017, China; 2. The Core Hospital of Chengdu Railway Bureau, Sichuan Chengdu 610031, China; 3. West China School of Pharmacy, Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041, China)

  [Abstract] Objective:To identify Rhizoma Anemarrhenae, Poria and Rhizoma Chuanxiong, and to assay jujuboside A in Suanzaoren mixture. Methods:TLC and HPLC were used.Results:The spots of TLC were fairly clear. The HPLC method showed good repeatability. The linear range was 0.55~1.1 mg/mL, and the average recovery of jujuboside A was 100.45% with RSD of 1.30%. Conclusions:The method is simple, repeatable, accurate, and can effectively control the quality of Suanzaoren mixture.

  [Key words] Suanzaoren mixture; TLC; HPLC; Jujuboside A

  酸枣仁合剂源于酸枣仁汤,出自汉代张仲景《金匮要略・血痹虚劳脉证并治第六》。方中酸枣仁养肝血、安心神为君药;川芎调血养肝、茯苓宁心安神为臣药;知母滋阴降火、清热除烦为佐药;甘草和中缓肝为使药。本方主治肝血不调、虚火内扰心神所致的心烦失眠等症。酸枣仁皂苷A为镇静催眠的有效成分之一,我们在文献[1]方法的基础上,改进提取、纯化方法,对酸枣仁合剂中酸枣仁皂苷A进行了测定,并对处方中部分药材进行了薄层鉴别,结果较为满意。

  1 材料与仪器

  LC�10A高效液相色谱仪(日本岛津公司),电子天平(B�N型,梅特勒�托利多仪器上海有限公司)。酸枣仁皂苷A对照品(734�9404),知母、茯苓和川芎对照药材均购自中国药品生物制品检定所,酸枣仁药材自购,经四川大学华西药学院王天志教授鉴定。酸枣仁合剂为四川志远嘉宝药业有限责任公司制备,其余试剂均为分析纯。

  2 薄层鉴别

  2.1 知母的薄层鉴别

  取酸枣仁合剂样品20 mL,加乙醇40 mL,超声处理30 min后,加入浓盐酸2 mL,超声处理30 min,过滤,滤液浓缩至约5 mL,加水10 mL,用苯萃取2次,每次20 mL,分取苯层,用1%氢氧化钠溶液10 mL洗涤1次后,水洗3次,每次10 mL,苯萃取液水浴挥干,残渣加苯1 mL溶解即得。另取知母对照药材3 g,用水50 mL回流提取1 h,过滤,滤液照供试品溶液方法制备知母对照药材溶液。取上述两种溶液各10 μL,分别点于同一含0.4%CMC�Na的硅胶G薄层板上,以苯�丙酮(10∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,于室温、日光下检视,样品色谱中,在与对照药材色谱相应位置上,显相同颜色的斑点,而阴性对照在相应位置无此斑点。

  2.2 茯苓的薄层鉴别

  取酸枣仁合剂样品20 mL,加乙酸乙酯30 mL,超声处理30 min,取乙酸乙酯层,即得。另取茯苓对照药材2 g,加乙酸乙酯10 mL,超声处理30 min,取乙酸乙酯层,即得茯苓对照药材溶液。取上述两种溶液各10 μL,分别点于同一含0.4%CMC�Na的硅胶G薄层板上,以环己烷�乙酸乙酯(5∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下观察,在与对照药材色谱相应位置上,显相同颜色的荧光斑点,而阴性对照在相应位置无此斑点。

  2.3 川芎的薄层鉴别

  取酸枣仁合剂样品20 mL,加乙醚50 mL,超声处理30 min,取乙醚层,减压浓缩至干,残渣加乙酸乙酯2 mL溶解即得。另取川芎对照药材3 g,加水50 mL回流提取1 h,过滤,滤液同供试品溶液制备方法处理即得川芎对照药材溶液。取上述两种溶液各10 mL,分别点于同一含0.4%CMC�Na的硅胶G薄层板上,以环己烷�乙酸乙酯�冰醋酸(2∶1∶0.1)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下观察,在与对照药材色谱相应位置上,显相同颜色的荧光斑点,而阴性对照在相应位置无此斑点。

  3 酸枣仁皂苷A含量测定

  3.1 色谱条件

  采用Hypersil�C18(4.6 mm ID×150 mm,5 μm)色谱柱,以乙腈�水(30∶70)为流动相,检测波长为204 nm,流速0.8 mL/min,柱温25 ℃。理论塔板数按酸枣仁皂苷A计算,不低于5 000,酸枣仁皂苷A与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5,见图1。

  图1 酸枣仁皂苷A液相色谱图

  3.2 供试溶液的制备

  取酸枣仁合剂供试品10 mL,置于处理好[装大孔树脂(20 mm×150 mm),用60%乙醇洗柱至无色,再用蒸馏水洗柱至无色,备用]的大孔树脂上,依次用蒸馏水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇洗涤小柱,分别洗至流出液无色,控制流出速度为2~3 mL/min,用液300 mL,收集60%乙醇洗脱成分,旋转浓缩至干,残渣用甲醇溶解,并定容为2 mL,摇匀,离心,取上清液进样。

  3.3 标准曲线的制备

  精密称取酸枣仁皂苷A对照品0.0110 g,置10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,备用。分别精密吸取酸枣仁皂苷A对照品溶液(1.1 mg/mL)适量,注入高效液相色谱仪,记录色谱图。以对照品峰面积为纵坐标,以对照品量(mg/mL)为横坐标,绘制标准曲线得回归方程:Y=1.677×105X-8.672×104(r=0.9997)。酸枣仁皂苷A在0.55~1.1 mg/mL浓度范围Y与X呈良好线性。

  3.4 精密度试验

  精密吸取对照品溶液10 μL,进样5次,峰面积积分值的RSD为1.13%,表明仪器进样精密度良好。

  3.5 重复性试验

  取同一批样品,制备6份供试样品溶液,并测定其酸枣仁皂苷A含量,6份含量的RSD为0.99%。

  3.6 加样回收率试验

  取已知含量的一批酸枣仁合剂(0.233 mg/mL)10 mL,分别加入酸枣仁皂苷A溶液1.60、2.0、2.4 mL(浓度为1.2 mg/mL),按“供试溶液的制备”方法进行处理测定并计算回收率,平均加样回收率为100.45%,RSD为1.30%,见表1。

  3.7 样品的测定

  取酸枣仁合剂供试品(批号为041101、041102、041103、050101、050102、050103)各10 mL,按“1.3.2项下”方法制备,并测定含量,结果分别为:0.231、0.234、0.235、0.227、0.236和0.233 mg/mL。表1 酸枣仁皂苷A的加样回收率注:酸枣仁合剂中酸枣仁皂苷A含量为0.233 mg/mL,平均加样回收率为100.45%。

  4 讨论

  酸枣仁中化学成分复杂,且酸枣仁皂苷A结构中无共轭体系,紫外吸收波长较短,检测极易受到干扰。对药材的测定,采用石油醚脱脂,氨水对正丁醇层进行碱化处理的方法,取得了很好的分离效果,且重现性良好。

  酸枣仁合剂中,成分复杂,黄酮类成分在紫外区的干扰,处方中知母、甘草也含有皂苷,对酸枣仁皂苷A的测定影响很大,因此在纯化过程中,既要排除黄酮类的干扰,也要排除其它皂苷的影响。

  对供试样品的预处理方法进行了筛选,索氏提取的酸枣仁合剂供试品,用水饱和的正丁醇萃取,发现干扰明显,酸枣仁皂苷A峰太小;选用大孔树脂柱处理,其主要用于水溶性化合物的分离纯化(因其在有机溶剂中的吸附能力极小),多用于皂苷及其它苷类化合物的分离。实验中,我们使用20%、40%、60%、80%乙醇分别洗脱,经测定,20%乙醇能将大部分水溶性成分洗脱出来,60%乙醇基本将酸枣仁皂苷A洗脱。

  本文采用TLC法鉴别酸枣仁合剂中知母、茯苓和川芎等药材,鉴别重复性好、专属性强,HPLC测定酸枣仁皂苷A的含量,方法简便、准确。

  【参考文献】

  [1] 李玉娟, 车镇涛. 反相高效液相色谱法测定酸枣仁中酸枣仁皂苷A的含量[J]. 中国中药杂志, 2000, 26(5): 309�310.

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