高效液相色谱法测定龙葵中的澳洲茄胺

　　【摘要】目的建立龙葵中澳洲茄胺的高效液相色谱（HPLC）检测方法。方法采用甲醇酸水超声提取龙葵生物碱，在回流条件下对生物碱苷进行酸性水解，得到相应的澳洲茄胺。然后进行高效液相色谱检测，色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm），乙腈-0.05%七氟丁酸（30∶70）体系为流动相，流速为1.0 ml/min，检测波长为210 nm。结果龙葵生物碱获得了良好的基线分离；澳洲茄胺的线性范围为102～612 μg・ml-1（r=0.999 9）；加样回收率超过96.0%，RSD为3.35%（n = 6）。结论该方法简单快速，准确可靠，可作为龙葵药材及其制剂的质量控制方法。该方法也为龙葵质量标准的制定及进一步的药效学研究提供了可靠的数据和方法学平台。

　　【关键词】 龙葵； 澳洲茄胺； 高效液相色谱

　　Abstract:ObjectiveTo develop a new quantitative method for determining solasodine in Solanum nigrum L. by high-performance liquid chromatography (HPLC).MethodsAfter sonic extracted with acidic methanol, the alkaloids were acid hydrolyzed with reflux, and then eluted with acetonitrile-0.05% heptafluorobutyric acid as mobile phase. The chromatography parameters were as follows: column: Diamonsil ODS analytical column; flow rate：1.0 ml/min; detection wavelength: 210 nm. ResultsBaseline separation was obtained for the alkaloids. Good linear range was found in the concentration range of 102～612 μg/ml with r= 0.999 9. The recoveries were no less than 96.0%, RSD was 3.35% (n=6). ConclusionThe proposed method is simple, fast, accurate and effective. It can be used as a powerful tool for quality control of Solanum nigrum L., also prvides a scientific and technical platform for setting up a quality standard and for further pharmaceutical study.

　　Key words:Solanum nigrum L.； Solasodine； HPLC

　　龙葵Solanum nigrum L.为茄科(Solanaceace)植物龙葵一年生草本植物，别名野葡萄、老鸦眼睛草、苦菜、苦葵［1］。龙葵全草均可入药，其生物活性成分主要包括甾体类生物碱、多糖、维生素A和维生素C等。其中，甾体类生物碱具有抗肿瘤活性，龙葵也因此被列为十大抗肿瘤中草药之一［2～5］。

　　龙葵生物碱主要以生物碱苷的形式存在［5］，由于苷元与生物碱苷存在对应关系，因此以苷元来定量龙葵生物碱是常用的分析手段。澳洲茄碱（solasonine）和澳洲茄边碱(solamargine)是龙葵的主要活性成分，它们水解后的苷元是澳洲茄胺(solasodine)（见图1）。文献常采用测定澳洲茄胺来定量龙葵生物碱，包括重量法、电位滴定法、比色法和薄层扫描法［6］。但是，这些方法操作繁琐，准确度差。近年来，高效液相色谱凭借其优异的分离分析能力已成为中药这一复杂体系的强有力的分析工具。最近，蒋新宇等［7］基于澳洲茄胺的分析，提出了一种龙葵中甾体类生物总碱的高效液相色谱检测方法。但该方法侧重于龙葵生物碱的提取、水解过程，其高效液相色谱检测过程仍有待进一步优化。本研究通过对提取分离各环节的实验优化和严格的方法学验证，提出了一种简单可靠的澳洲茄胺的高效液相色谱定量方法。

　　1 器材与方法

　　1.1 仪器与试剂Agilent 1100 Series高效液相色谱仪；电子天平(Mettler AE 240，德国)；KQ318T型超声清洗器（昆山市超声波仪器公司）；高速粉碎机（FW-100型，北京市永光明医疗器械厂）；pHS-3C酸度计（上海雷磁分析仪器公司）。

　　澳洲茄胺(Solasodine)对照品购自Sigma-alderich公司（圣路易斯，美国）；流动相用的甲醇和乙腈均为色谱纯，其余试剂为分析纯。全程使用二次蒸馏水。

　　龙葵药材全草购自南昌汇仁堂药店。龙葵果实由江西樟树某药材经销商友情提供，经常规植物分类学方法鉴定为茄科(Solanaceace)植物龙葵的果实。

　　1.2 色谱条件Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm）。流动相为乙腈-0.05%七氟丁酸（30∶70）；流速1.0 ml/min；检测波长210 nm；进样量20 μl。

　　1.3 溶液的制备

　　1.3.1 对照品溶液精密称取对照品适量，加甲醇溶解，所得澳洲茄胺的浓度为1.02 mg/ml。

　　1.3.2 样品溶液精密称取龙葵药材2 g，加甲醇20 ml，1.0 M盐酸10 ml，超声提取40 min，收集上清液，滤过。向滤液中续加6 M盐酸5 ml，回流水解1 h。趁热挥去回流液中的甲醇，以氨水调pH值至10，继以醋酸乙酯萃取两次。分取醋酸乙酯层，挥干溶剂，残渣以适量甲醇溶解，转入10 ml容量瓶，以甲醇稀释至刻度，分析前以0.45 μm滤膜滤过。对龙葵果实的样品溶液，在进样前稀释10倍。以澳洲茄碱水解为澳洲茄胺为例，水解反应示意图见图1。

　　2 结果

　　2.1 提取方法的选择文献多采用回流法提取龙葵生物碱，该方法繁琐费时。近年来，超声提取法已被广泛应用于中药活性成分的提取。本实验对这两种提取方法做了系统比较，发现超声提取简单快速，且能达到相同的提取效率。此外，对龙葵生物碱的水解条件诸如溶液pH，甲醇含量，水解时间等进行了考察，获得了上述优化条件（见“1.3 溶液的制备”项）。

　　图1 澳洲茄碱水解得到澳洲茄胺的示意图（略）

　　2.2 色谱条件的确定澳洲茄胺分子缺少共轭双键结构，紫外吸收较弱，对其进行紫外检测时只能要么进行衍生，要么选择其末端吸收。当采用末端吸收波长进行检测时，色谱流动相最好采用截止波长低的乙腈。但是，龙葵生物碱的色谱保留不强，如果采用洗脱强度大的流动相，势必影响分离。同样，由于采用末端吸收进行检测，也不利于梯度洗脱，否则基线漂移严重。在大量实验的基础上，我们优选了“1.2”项所述的色谱检测条件。如图2所示，在该条件下，澳洲茄胺在真实样品中获得了良好的基线分离。

　　图2 典型的高效液相色谱图（略）

　　2.3 方法学验证

　　2.3.1 标准曲线 精密吸取澳洲茄胺储备溶液0.5 ，0.8，1.0，2.0，2.5 ml和3.0 ml各置于5 ml的容量瓶配成标准系列，按上述色谱条件进样分析，在102～612 μg/ml范围内，对样品浓度（X）与峰面积（Y）进行回归分析，得回归方程Y = 689.52X+3.65，r=0.999 9。

　　2.3.2 精密度实验 取上述供试品溶液20 μl，在上述色谱条件连续进样6次测定，澳洲茄胺峰面积的RSD为1.45%，符合含量测定要求。

　　2.3.3 回收率实验 精密称取龙葵药材6份，分为3组，依次按本底含量的50%，100%和150%加入澳洲茄胺对照品，按照供试品制备与测定方法，计算回收率。澳洲茄胺的平均回收率为96.0%，RSD=3.35%（n=6）。

　　2.4 样品测定按照“1.3”项条件制备龙葵样品溶液,依“1.2”项条件进样分析，图2-b是龙葵全草的典型色谱图。按照外标法所得龙葵全草和成熟果实中的澳洲茄胺含量如表1。结果显示，澳洲茄胺在龙葵果实中的含量明显高于其在全草中的含量。

　　表1 龙葵中澳洲茄胺的含量（略）

　　3 结论

　　澳洲茄碱与澳洲茄边碱是龙葵药材中的主要抗肿瘤活性成分。它们主要以澳洲茄胺为苷元的生物碱苷的形式存在于龙葵中，其含量在龙葵果实中最高，全草次之。由于澳洲茄碱和澳洲茄边碱与澳洲茄胺存在着一一对应的化学计量比关系，因此，以澳洲茄胺作为龙葵生物碱含量的评判指标是可行而且可靠的。本文所开发的方法简单快速，准确可靠，可作为龙葵药材及其制剂的质量控制方法。

　　【参考文献】

　　［1］ 徐东花, 于春月, 韩成花. 龙葵的化学成分及药理作用研究［J］.黑龙江中医药, 2007, 36 (2): 46.

　　［2］ 张海洋. 值得开发的植物资源-龙葵［J］.北方园艺, 1997, 117 (6):13.

　　［3］ 那顺孟和, 杨秋林, 米 拉. 野生龙葵中矿物质和维生素含量的分析研究［J］.内蒙古农业大学学报，2000, 21 (9)：88.

　　［4］ 季宇彬, 王胜惠, 高世勇, 等. 龙葵活性成分的研究［J］.哈尔滨商业大学学报(自然科学版)，2000, 20 (6)：637.

　　［5］ 陈汝盛，厉将斌，郭晓健，等. 猪苓龙葵水提物的抗肿瘤药效［J］.中国中药杂志, 2004, 29(5): 481.

　　［6］ 梁生旺, 王浴铭, 张广强, 等. 薄层扫描法测定龙葵中澳洲茄胺的含量［J］.中国药学杂志, 1997, 32 (8): 494.

　　［7］ 蒋新宇, 杨 辉, 赵 宇. 龙葵中甾体类生物总碱的含量测定［J］.食品科学, 2006, 27 (8): 224.