DNA磷硫酰化修饰依赖的新型限制系统
伯豪生物
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近日，上海交通大学生命科学技术学院、微生物代谢国家重点实验室在DNA磷硫酰化修饰研究方面取得新进展，由德林教授研究小组与美国麻省理工学院Peter C. Dedon教授课题组合作，博士生曹博为第一作者，在分子微生物学领域权威期刊《Molecular Microbiology》上发表研究性论文，揭示了DNA磷硫酰化修饰依赖的限制系统的作用机理，阐明了该限制系统完全不同于传统的甲基化修饰限制系统多方面作用特征。
背景介绍
DNA磷硫酰化修饰是由硫原子取代了DNA磷酸骨架上非桥联氧原子，进而形成具有序列特异性和空间构象专一性的DNA大分子结构。这是表观遗传学领域近年发现的一种新型生理修饰现象，它突破了现有的DNA骨架由碳、氢、氧、氮、磷五种元素构成的结论，拓展了经典的DNA组成理论，在国内外引起了广泛关注。但对这种修饰的生理功能的研究一直是该领域的一个挑战。
表观遗传学修饰如DNA甲基化修饰经常通过限制修饰系统，与细菌的自我防卫机制紧密相关。所谓“限制修饰系统”是原核生物在进化过程中形成的遗传信息保护机制。“限制”如同特殊的刀，而“修饰”好比定制的盾。当细菌被入侵后，外来的DNA会被“限制”消灭，自身的DNA由于被“修饰”而得到保护。经典的甲基化限制修饰系统中，一旦“修饰”被破坏，“限制”会无节制地破坏细菌DNA，最终导致细菌的死亡。
由德林研究小组近期研究证实，DNA磷硫酰化修饰参与了一种新型限制修饰系统 (Xu et al, Nucleic Acids Research, 2010, 38(20): 7133-41)。通过解析含有该限制系统的细菌基因组磷硫酰化修饰图谱，由德林小组又发现了其保守修饰序列具有高度部分修饰的现象 (Cao et al, Nature Communication, 2014, 5: 3951)。在传统的限制系统中，限制酶会会对不含修饰的保守序列进行切割，从而造成DNA的断裂。而在DNA磷硫酰化修饰依赖的限制系统中，只有一部分保守序列发生了修饰，这就暗示着该限制系统与已知的限制系统具有不同的作用机制。
结果分析
研究小组首先探索了DNA 磷硫酰化修饰依赖的限制系统的作用机理。在含有该限制修饰系统的一株沙门氏菌中，发现这一新型限制系统与传统的DNA甲基化依赖的限制系统相比，具有多方面不同的特征。首先，磷硫酰化修饰基因缺失突变株中，限制系统的存在并不具有致死效应，而是赋予突变株多种表型变化：多种不可溶蛋白在液体培养基中积累，其中包括核糖体蛋白、DNA 修复蛋白、膜蛋白等；菌落形态异常；生长缓慢；细胞分裂障碍；细胞膜损伤等。虽然DNA 磷硫酰化修饰基因缺失突变株中，限制系统不具有致死效应，但是野生型菌株中限制基因的表达是受到严格调控的，因为限制基因的过量表达对含有修饰的宿主具有致死性。
揭示了该限制系统对修饰缺失宿主的表型影响之后，研究小组进一步利用基因芯片技术分析了限制酶对该宿主的基因组转录谱的影响（本课题中Agilent基因芯片分析基因组转录谱服务由上海伯豪生物技术有限公司提供）。基因芯片研究修饰基因缺失突变株的基因组转录谱发现，共有600多个基因与野生型相比发生明显变化，其中主要为上调基因，包括细菌噬菌体基因、DNA 损伤修复系统、SOS 应激反应系统等。这些基因编码的功能与宿主所呈现的异常生理表型非常吻合。其中，基因芯片揭示的DNA 损伤修复系统、SOS 应激反应系统的启动，暗示了菌株中DNA损伤的发生。
最后，TUNEL实验检测到修饰基因缺失突变株中，限制基因导致了细胞内DNA断裂损伤的出现，与基因芯片结果相符。此外，体外实验证明，组成限制系统的3个蛋白系统中，DptF 和DptH 具有ATP 水解酶活性。以上结果表明，DNA 磷硫酰化修饰依赖的限制系统的表达在细胞内是受到严格调控的，且其限制功能为ATP 依赖的、并以某种方式导致不含修饰的DNA 发生断裂损伤的作用机理。
该研究不仅拓展了对DNA磷硫酰化修饰的生理功能的认识，而且揭示了DNA磷硫酰化修饰依赖的限制系统是完全不同于传统的限制修饰系统—前者在基因组DNA部分修饰条件下，具有基于DNA断裂的非致死性的特殊保护机制，而后者通常无法在突变的情况下维持微生物的生存。这一新的发现加深了人们对自然界中基因组防御系统多样性的理解和认识。
原文出处：Bo Cao, Qiuxiang Cheng, Chen Gu, Fen Yao, Michael S. DeMott, Xiaoqing Zheng, Zixin Deng, Peter C. Dedon and Delin You. Pathological phenotypes and in vivo DNA cleavage by unrestrained activity of a phosphorothioate-based restriction system in Salmonella. Molecular Microbiology, 2014, 93 (4): 776-785.
背景介绍
DNA磷硫酰化修饰是由硫原子取代了DNA磷酸骨架上非桥联氧原子，进而形成具有序列特异性和空间构象专一性的DNA大分子结构。这是表观遗传学领域近年发现的一种新型生理修饰现象，它突破了现有的DNA骨架由碳、氢、氧、氮、磷五种元素构成的结论，拓展了经典的DNA组成理论，在国内外引起了广泛关注。但对这种修饰的生理功能的研究一直是该领域的一个挑战。
表观遗传学修饰如DNA甲基化修饰经常通过限制修饰系统，与细菌的自我防卫机制紧密相关。所谓“限制修饰系统”是原核生物在进化过程中形成的遗传信息保护机制。“限制”如同特殊的刀，而“修饰”好比定制的盾。当细菌被入侵后，外来的DNA会被“限制”消灭，自身的DNA由于被“修饰”而得到保护。经典的甲基化限制修饰系统中，一旦“修饰”被破坏，“限制”会无节制地破坏细菌DNA，最终导致细菌的死亡。
由德林研究小组近期研究证实，DNA磷硫酰化修饰参与了一种新型限制修饰系统 (Xu et al, Nucleic Acids Research, 2010, 38(20): 7133-41)。通过解析含有该限制系统的细菌基因组磷硫酰化修饰图谱，由德林小组又发现了其保守修饰序列具有高度部分修饰的现象 (Cao et al, Nature Communication, 2014, 5: 3951)。在传统的限制系统中，限制酶会会对不含修饰的保守序列进行切割，从而造成DNA的断裂。而在DNA磷硫酰化修饰依赖的限制系统中，只有一部分保守序列发生了修饰，这就暗示着该限制系统与已知的限制系统具有不同的作用机制。
结果分析
研究小组首先探索了DNA 磷硫酰化修饰依赖的限制系统的作用机理。在含有该限制修饰系统的一株沙门氏菌中，发现这一新型限制系统与传统的DNA甲基化依赖的限制系统相比，具有多方面不同的特征。首先，磷硫酰化修饰基因缺失突变株中，限制系统的存在并不具有致死效应，而是赋予突变株多种表型变化：多种不可溶蛋白在液体培养基中积累，其中包括核糖体蛋白、DNA 修复蛋白、膜蛋白等；菌落形态异常；生长缓慢；细胞分裂障碍；细胞膜损伤等。虽然DNA 磷硫酰化修饰基因缺失突变株中，限制系统不具有致死效应，但是野生型菌株中限制基因的表达是受到严格调控的，因为限制基因的过量表达对含有修饰的宿主具有致死性。
揭示了该限制系统对修饰缺失宿主的表型影响之后，研究小组进一步利用基因芯片技术分析了限制酶对该宿主的基因组转录谱的影响（本课题中Agilent基因芯片分析基因组转录谱服务由上海伯豪生物技术有限公司提供）。基因芯片研究修饰基因缺失突变株的基因组转录谱发现，共有600多个基因与野生型相比发生明显变化，其中主要为上调基因，包括细菌噬菌体基因、DNA 损伤修复系统、SOS 应激反应系统等。这些基因编码的功能与宿主所呈现的异常生理表型非常吻合。其中，基因芯片揭示的DNA 损伤修复系统、SOS 应激反应系统的启动，暗示了菌株中DNA损伤的发生。
最后，TUNEL实验检测到修饰基因缺失突变株中，限制基因导致了细胞内DNA断裂损伤的出现，与基因芯片结果相符。此外，体外实验证明，组成限制系统的3个蛋白系统中，DptF 和DptH 具有ATP 水解酶活性。以上结果表明，DNA 磷硫酰化修饰依赖的限制系统的表达在细胞内是受到严格调控的，且其限制功能为ATP 依赖的、并以某种方式导致不含修饰的DNA 发生断裂损伤的作用机理。
该研究不仅拓展了对DNA磷硫酰化修饰的生理功能的认识，而且揭示了DNA磷硫酰化修饰依赖的限制系统是完全不同于传统的限制修饰系统—前者在基因组DNA部分修饰条件下，具有基于DNA断裂的非致死性的特殊保护机制，而后者通常无法在突变的情况下维持微生物的生存。这一新的发现加深了人们对自然界中基因组防御系统多样性的理解和认识。
原文出处：Bo Cao, Qiuxiang Cheng, Chen Gu, Fen Yao, Michael S. DeMott, Xiaoqing Zheng, Zixin Deng, Peter C. Dedon and Delin You. Pathological phenotypes and in vivo DNA cleavage by unrestrained activity of a phosphorothioate-based restriction system in Salmonella. Molecular Microbiology, 2014, 93 (4): 776-785.
