棕榈酰化修饰的检测——免疫印迹

蛋白质棕榈酰化修饰是一种可逆的翻译后脂质修饰，通常被认为可以调节蛋白质的亚细胞定位。

首先使用树脂辅助捕获酰化蛋白结合免疫印迹评估蛋白棕榈酰化修饰水平。

免疫印迹是将混合抗原样品在凝胶板上进行单向或双向电泳分离， 然后取固定化基质膜与凝胶相贴。

在印迹纸的自然吸附力、电场力或其它外力作用下， 使凝胶中的单一抗原组份转移到印迹纸上， 并且固相化。

最后应用免疫覆盖液技术如免疫同位素探针或免疫酶探针等， 对抗原固定化基质膜进行检测和分析。

检测某种蛋白是否发生了棕榈酰化修饰，配合质谱技术可以找到具体的棕榈酰化修饰的位点。

试剂：

NEM、无水乙醇、蛋白酶抑制剂、ddH₂O

HEPES、EDTA、SDS

HRP 标记的山羊抗兔抗体、HE 染色试剂盒

快速配胶试剂盒、PVDF 膜

仪器：

冰箱、pH 计、离心机、电泳仪

化学发光成像系统

1、试剂配制

1）2 M NEM：0.25 g NEM 粉末 + 1 mL 无水乙醇；

1 M DTT：1.54 g DTT粉末 + 10 mL 0.01 M 乙酸钠；

0.01 M 乙酸钠：1.36 mg 乙酸钠粉末 + 1 mL ddH₂O；

2 M 羟胺（HAM）：613 μL HAM + 10 mL ddH₂O；

1 M HEPES：2.38 g HEPES + 10 mL ddH₂O；

0.1 M EDTA：0.37 g EDTA + 10 mL ddH₂O。

2）Blocking Buffer（10 mL）：100 mM HEPES + 1 mM EDTA + 2.5% SDS 粉末 + 50 mM NEM（现用现加），使用前调 pH = 7.5，并加蛋白酶抑制剂。

3）Binding Buffer（10 mL）：100 mM HEPES + 1 mM EDTA + 1% SDS 粉末，使用前调 pH = 7.5，并加蛋白酶抑制剂。

2、捕获酰化蛋白

1）取待测蛋白样品，将含有 NEM 的 Blocking Buffer 加入蛋白溶液中，常温孵育 10 分钟，NEM 可封闭蛋白质半胱氨酸 Cys 上所有自由巯基。

2）沉淀蛋白：将封闭后的样本加入 3 倍体积的冷丙酮（负 20 度先预冷好），放入负 20 度沉淀 3 小时。5000 g，离心 10 分钟，弃上清，留沉淀。

3）用 70% 的丙酮洗涤沉淀两次，用 Binding Buffer 重悬沉淀，沉淀很硬，先用枪头吹打，再用针头混匀。

4）取 300 μL 作为 Input 组，加 100 μL 的 4X 蛋白上样缓冲液 Loading Buffer，煮 10 分钟，负 20 度保存。

5）取 0.05 g 硫丙基琼脂糖 6B，每个样备两个管子（HAM-， HAM+），用 1.5 mL ddH₂O 重悬混匀，5000 rcf，离心 3 分钟，吸去上清；再用 1.5 mL ddH₂O 洗涤硫丙基琼脂糖 6B 两次，5000 rcf，离心 3 分钟，吸去上清。

6）将每个样的样本平均分成两份，加入含有硫丙基琼脂糖 6B 的两个管子（HAM-， HAM+），HAM- 组：加 NaCl 作为对照；HAM+ 组：加 2M 的 HAM（羟胺），4 度，过夜孵育。

7）以 5000 g 离心 3 分钟，去上清。琼脂糖用 1 mL Binding Buffer + 8 M urea，洗涤 5 分钟，共 5 次。加入 150 μL 的 Binding Buffer + 50 mM DTT，常温孵育 20 分钟。

8）5000 g，离心 3 分钟，取上清，加 4X 蛋白上样缓冲液 Loading Buffer，煮 10 分钟，负 20 度保存。

3、WB检测

1）配置合适浓度的分离胶和浓缩胶（快速配胶试剂盒）。

2）在加样孔内加入等量的步骤 2 得到的待测蛋白样本以及蛋白 marker。110 V 恒压电泳，待溴酚蓝跑至波板边缘的位置停止电泳（根据需要可延长或缩短电泳时间）。

3）配置电转液：6.06 g Tris + 28.8 g 甘氨酸 + 400 mL 甲醇，ddH₂O 定容至 2 L。根据目的蛋白的分子量切胶，活化 PVDF 膜（将膜依次置于甲醇，ddH₂O，电转液），在转膜的夹板上依次放上海绵，滤纸，胶，膜，滤纸，海绵，合上并夹紧夹板，放入转膜筐，250 mA 恒流转膜。

4）配置 TBST：18 g NaCl + 6 g Tris + Tween20 2 mL + 浓盐酸 2 mL，ddH₂O 定容至 2 L。

5）配置封闭液：BSA:TBST = 3g:100mL，按每张膜 4 mL 的量加入膜条带孵育盒。

6）转膜完成后，将膜条带置于封闭液中，37 度摇床，1 小时。

7）孵育一抗，按照抗体说明书用封闭液稀释一抗原液，将条带置于一抗中，4 度过夜孵育。TBST 中洗 3次，每次 10 分钟。

8）将条带放入稀释好的二抗中，室温孵育 1 小时。 TBST 中洗 3 次，每次 15 分钟。

9）配置显影液，均匀覆盖条带，放入显影仪显影，保存图片。

蛋白样品要注意保持活性，低温轻柔操作。

棕榈酰化修饰的丰富可能比较低，比较难以检测，可以尝试使用点击化学法、生物学交换法等来检测。