溶血反应的检测试剂

（一）补体

检测血清补体水平或补体活性时需要从受检者采血及分离血清。做补体结合试验时多采用豚鼠血清作为实验用补体的来源。因为补体在体外极易衰变，所以检测补体活性的血清标本和作为补体试剂的血清必须新鲜。

受检者一般做静脉采血，在动物可做心脏采血。血清分离后应及时使用，最好在当日用完。必须保存时采用小量分装的办法，置－70℃下可保存数月，避免反复冻融。冻干制品可长期保存，但其活性都不同程度地比新鲜血清降低。

以豚鼠血清作补体来源时，应考虑到个体差异。为了确保血清中补体的有效活性，必须取3只以上豚鼠的血清混合后使用。

（二）绵羊红细胞

从绵羊颈静脉无菌采血，抽出血液后立即小心地注入放有玻璃珠的无菌干燥三角烧瓶中，充分旋摇15～20min，以除去纤维蛋白。也可将羊血与等量或2倍量的Alsever血液保存液混合，既有抗凝作用，又适于储存；分装后置4℃，可使用3周。

实验前，取适量抗凝血，加入8～10倍的生理盐水，轻轻混匀后2000r/min离心5min；弃上清，沉淀的红细胞用生理盐水再洗一次，这时上清为无色澄清，如显红色说明有溶血现象，应更换新鲜羊血；第三次用缓冲液洗涤，弃上清，取压积红细胞用缓冲液配制SRBC悬液，使用浓度一般为2%～5%.为使红细胞浓度标准化，可吸取少量红细胞悬液，中入20～30倍的稀释液中，在542nm波长比浊，以吸光度为标准调整红细胞浓度。

（三）溶血素

溶血素即抗绵羊红细胞抗体，多是以绵羊红细胞免疫家兔而得到兔抗血清。一般没有必要进一步提纯抗体，但在试验前需先进行加热56℃30min或60℃3min以灭活补体。

由于补体溶血试验及补体结合试验均是比较精密的试验，其结果与溶血素的效价有关，所以试验需要滴定溶血素效价；在制备抗血清的过程中，于动物采血前和分离抗血清后也需要滴定溶血素效价。

1.溶血素稀释稀释溶血素时，要先对效价有个大概的估计，以便确定稀释度的范围。动物采血前滴定时稀释范围要稍大些，实验前的滴定便以原先的记录作为参考（溶血素的效价多在数千单位以上）。医学|教育网搜集整理溶血素稀释一般不采用连续倍比稀释法，因为稀释到最后时跨度太大，不容易确定单位。为了便于操作，现举例按表14-1配制不同稀释度的溶血素。

表14-1不同浓度溶血素的配制

 

最终稀释度	缓冲液（ml）	所加溶血素
稀释度	体积（ml）
1:1000	1.8	1:100	0.2
1:2000	0.2	1:1000	0.2
1:3000	0.4	1:1000	0.2
1:4000	0.2	1:2000	0.2
1:5000	0.8	1:1000	0.2
1:6000	0.2	1:3000	0.2
1:8000	0.2	1:4000	0.2
1:10000	0.2	1:5000	0.2

2.效价滴定将稀释好的溶血素及其他试剂按表14-2所示逐步加入到各试管中，放置37℃水浴，不要盖上水浴箱的盖子，以免盖子上冷凝的水蒸气滴入试管内引起非补体性溶血。30min后取出观察结果。

 

表14-2溶血素的滴定

 

管号	溶血素稀释度	试管内加的各种试剂材料	结果
溶血素（ml）	1:60稀释补体（ml）	缓冲液（ml）	20%羊红细胞（ml）
1	1:1000	0.1	0.2	0.2	0.1	全溶
2	1:2000	0.1	0.2	0.2	0.1	全溶
3	1:3000	0.1	0.2	0.2	0.1	全溶
4	1:4000	0.1	0.2	0.2	0.1	全溶
5	1:5000	0.1	0.2	0.2	0.1	大部分
6	1:6000	0.1	0.2	0.2	0.1	微溶
7	1:8000	0.1	0.2	0.2	0.1	不溶
8	1:10000	0.1	0.2	0.2	0.1	不溶
9	（对照）	－	－	0.5	0.1	不溶

温育反应后，完全溶血的试管内液体红色透明，放置一段时间后管底无细胞沉淀，离心后可见少许细胞碎渣。不溶血的管内液体浑浊；放置后可见红细胞沉淀，上清无色透明。不同程度的不完全溶血介于两者的中间变化态。

 

按照以上标准，以产生完全溶血的最高稀释管为最大有效反应管，以该管的溶血素稀释倍数为溶血素产效价。例如表14-2中的溶血素效价应为1：4000；在1：4000稀释的情况下，反应液中所含溶血素的的量为1U/ml.

做补体活性测定或补体结合试验时，一般使用2U/ml溶血素（在本例做1：2000稀释），与SRBC悬液等体积混合。

（四）稀释缓冲液

磷酸缓冲液或巴比妥缓冲液等均可用于溶血试验医学|教育网搜集整理，pH值应调至7.2～7.4之间。另加入适量氯化钠以保持等渗，并适当地加入一些钙离子和镁离子，这是补体活化所不可缺少的。有的配方还加入0.1%的明胶以使蛋白溶液稳定；加入0.01%NaN3可以防腐，利于较长时间保存。