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细菌AmpC酶的检测方法

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按照Bush-Jocoby-Medeiros分类法(1995),细菌产生的β-内酰胺酶可分四型,其中1型β-内酰胺酶是头孢菌素酶,由一组位于染色体上的Amp基因编码并控制。这类酶与超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的区别在于克拉维酸等酶抑制剂对前者并无大的影响,而对后者往往能抑制其活力。前者对头孢西丁耐药,而后者相反。1型β-内酰胺酶可分染色体介导和质粒介导,通常具有可诱导性质,一旦形成去阻遏表达则可持续高产此种β-内酰胺酶。1989年Bauernfeid等首次报道在汉城发现的一株革兰阴性菌的1 型β-内酰胺酶基因位于可转移的质粒上(质粒AmpC),这种新的耐药表型因其较快的传播速度和较强的耐药性,开始逐渐引起人们的关注,在以每年发现1~2个新酶的速度持续增加。同时在临床常规药敏检测中发现,质粒AmpC对β-内酰胺类药物的表型有时并不一定耐药。所以,对于质粒介导AmpC酶的实验室检测显得尤为重要。目前,头孢西丁三维试验能检测AmpC酶。
1.直接法:将试验菌株制成浊度为0.5麦氏单位的菌悬液,用棉棒均匀涂布于MH平板上。将35mm长的双面刀片经火焰消毒后,在已生长试验菌株的血平板上轻压,使刀口均匀地沾上试验菌株。注意不要划破琼脂表面。然后将刀口向下,垂直插入已涂布试验菌株的MH平板。刀口插入后位置不要移动。再轻轻拔出刀片使MH平板上的刀口切割线自然闭合。刀口菌量不宜过多,以免溢出琼脂表面。随后在切割线中心,距切割线3mm处贴上头孢西丁纸片。将MH平板放入35℃孵箱过夜。
2.间接法:将ATCC25922大肠埃希菌制成0.5麦氏单位的菌悬液,均匀涂布于MH平板。其他操作同直接法。
结果判断:如果试验菌切割线附近的抑菌圈缩小或变形均提示头孢西丁失活,为头孢西丁三维试验阳性,即1型酶阳性。但这种方法不能区别是诱导酶还是去阻遏表达的酶。
要检测去阻遏持续高产AmpC酶,可按标准的纸片扩散法操作,将0.5麦氏单位大肠埃希菌ATCC25922菌液涂布于M-H平板上,取30微克头孢西丁纸片置于平皿中心,使用手术刀片在离纸片边缘3-5mm处放射状地由里向外切割一道狭缝,用微量加样器取40微升受试菌酶粗提取物由里向外加入狭缝内,尽量避免酶液溢出狭缝。将MH平板放入35℃孵箱过夜。若观察到狭缝与抑菌圈交接处出现扩大的长菌区域,视为三维试验阳性,即AmpC酶试验阳性。

 

 

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