液体芯片-飞行时间质谱技术在肿瘤早期诊断中的研究进展

中文摘要：

　　液体芯片-飞行时间质谱技术利用磁珠俘获肿瘤患者与健康对照体液中低丰度特异蛋白或多肽，经飞行时间质谱测定和软件分析，建立由两者差异表达蛋白或多肽组成的质谱图模型，用于预测未知样品的归属。

　　它的优点在于：1、俘获的低丰度蛋白或多肽种类多，保证了系统的特异性。在仅一滴血清（10-50μL）中，在分子量范围为0.8-15kDa内，可检测出400多个不同的峰；

　　2、磁珠种类多，有多达十几种磁珠，适用于不同的疾病和蛋白；

　　3、操作简单快捷；

　　4、纳米磁珠巨大的表面积使蛋白的俘获具有良好的重复性；

　　5、样品处理通量高，每天可处理多达3万个样品；

　　6、消耗品价格低，只有同类产品价格的一半左右；

　　7、质谱系统拥有多项专利技术，TOF可检测出含量低至1fmol的蛋白，并可对高丰度的蛋白或多肽进行直接鉴定。

　　在哈佛大学女子医院、纽约斯隆-凯特琳癌症研究所、麻省总医院、贝勒医学院等世界一流医院和医学研究所中，该技术已广泛应用于卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、脑胶质瘤、头颈鳞癌、膀胱癌等的早期诊断研究中。其中在德国，该技术已应用于临床急性淋巴白血病的辅助诊断。综上所述，液体芯片飞行时间质谱技术具有良好的特异性和灵敏度、高通量、操作简单快捷和重复性好等优点，是极具潜力的临床肿瘤早期诊断工具。

Liquid　Chip　Time-Of-Flight　Spectrometry-A　Promising　Platform　For　Tumor　Early　Diagnosis

Wan Lichuan¹ Wang Yajie² Ma Qinwei¹, Kang Xixiong²
1. *Beijing Bioyong Technologies Inc., Beijing, 10080, China
2. Laboratory Medicine, Beijing Tiantan Hospital

Abstract：

　　The liquid chip time-of-flight spectrometry technology uses magnetic beads　to capture low abundance and specific proteins or polypeptides from body fluids of　both tumor patients and health controls. After MALDI-TOF measurements and　bioinformatics software analysis, discriminatory proteins or polypeptides were　employed to discover a biomarker pattern. Then unknown samples can be matched　against this pattern. T

　　he platform has the following advantages. a) Proteins/peptides at　low level can be captured by the magnetic beads. Over 400 different kinds of proteins　can be detected in a single droplet of serum (10-50μl) within a molecular mass　arrange of 0.8-15kD.

　　b) More than ten kinds of magnetic beads are commercially　available for studying different diseases and various proteins.

　　c) The process for　sample fractionation and measurement is easy and fast.

　　d) Good reproducibility was　guaranteed by the large surface of the magnetic beads.

　　e) The platform is also suitable　for high throughput sample analysis. More than 30,000 samples can be analyzed in　just one day.

　　f) The cost of the magnetic beads is low, only about half price of the　solid chips in the similar technologies.

　　g) The high quality of the mass spectrometry　system with various patent technologies is able to detect proteins at 1fmol level. High　abundant peptides can be identified directly by TOF/TOF.

　　The platform has been used　by the world’s first class hospitals and medical institutes, such as Women’s Hospital　of Harvard University, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, General Hospital of　Massachusetts, Baylor College of Medicine, where it was applied for the early　diagnosis research of ovary cancer, prostate cancer, breast cancer, glioblastoma, head　and neck squamous cell cancer, bladder cancer. In German, the platform was applied　for auxiliary diagnosis of acute lymphatic leukemia. In summary, the liquid chip　time-of-flight spectrometry technology is a very promising tool for tumor early　diagnosis because of the high specificity and sensitivity, high throughput, easy and　simple manipulation and high reproducibility.

Key Words：MALDI-TOF, Liquid Chip, Early Diagnosis, Cancer, Magnetic Bead

1．前言

　　世界卫生组织最新资料库显示：2005年，全球大约有760万人死于各种癌症，约1千1百万人被诊断患有癌症；中国死于恶性肿瘤的人数约为160万人，约2百万人被诊断患有癌症。中国每年因癌症造成的损失高达数百亿，给家庭和社会带来沉重的经济负担。

　　据世界卫生组织估计，早期肿瘤治愈率可达83%。美国从1960到1990的30年间，肿瘤患者的五年存活率由50％上升为63％，主要归功于早期诊断技术的发展，而中晚期的患者的五年存活率，几乎没有提高。临床上，早期诊断率每增加1％，全球就有约76万人免于死亡，中国约有16万人可获得新生，可挽回数以10亿计的损失。因此，大力推进早期诊断技术的发展，具有非常紧迫的经济和社会意义。生理医学诺贝尔奖获得者Lee Hartwell博士在2004年第21届国际肿瘤标志学术会议上，就如何治疗癌症指出：早期诊断可以治疗癌症，早期诊断癌症的最新、最有效的方法是验血诊断，寻找肿瘤标志，特别是其中的蛋白标志！

　　肿瘤标志物是指肿瘤细胞在发生、增殖、转移或复发过程中，所产生或分泌到血液、尿液、脑脊髓液等中，反映肿瘤存活和生长状态的一类物质。它能用化学、免疫、分子生物学或蛋白组学的方法进行定性、定量地检测。肿瘤标志物一般与肿瘤的发生、发展、转移、治疗后的消退、复发等具有良好的相关性。因此通常通过测定血清中肿瘤标志物的水平，可以进行肿瘤的早期诊断、个体化治疗、手术、放疗或药物疗效的观察、评判预后及预报复发等。

　　目前临床常用的肿瘤标志物有20多种，如PSA、CEA或CA125等，但大部分只能用于疗效的观察、评判预后及预报复发，能用于大规模人群的普查的肿瘤标志物寥寥无几。临床上迫切需要新的肿瘤标志物应用于肿瘤的早期诊断。

　　现代蛋白质组学的出现和发展，如双向电泳技术、蛋白芯片，电喷雾质谱和飞行时间质谱、四级杆飞行时间质谱、傅立叶变换质谱技术的发展，给临床肿瘤早期标志物的发现带来了划时代的革命，它将传统的通常一次只能测定一个蛋白标志物革命性地发展到一次可测定数十个，甚至数百个蛋白，同时极大的提高了诊断的灵敏度和特异性_[1]。

　　固体芯片飞行时间质谱技术是质谱技术应用于临床肿瘤早期诊断的先驱_{[2]、[3]、[4]、[5]}。它是第一个在临床上使用蛋白芯片技术，分离纯化蛋白，并应用飞行时间质谱和软件分析来寻找新肿瘤早期标志物。与双向电泳和液质联用质谱技术相比，其优势是简便易行、样本用量少并可同时进行高通量分析, 可直接对粗样本(血清、组织、细胞裂解液、尿液等)进行检测。随着该技术在临床研究中的更多应用，研究人员发现，它需要进一步的完善_{[6]、[7]、[8]}。

　　如，1、重复性亟待提高。不同的研究人员研究同一种癌症得到的差异峰应大部分相同；诊断模型的特异性在不同的时间要有较好的一致性。

　　2、灵敏度需要进一步提高。肿瘤早期标志物的一个最显著的标志是其在血清中浓度非常低。如在正常男性血清中，PSA的浓度在1μg/L以下，而该技术检测的下限是1000μg/L。

　　3、能对寻找到的差异蛋白进行进一步的鉴定和分析。

　　4、每次分离的蛋白数量和质量范围需要进一步扩大。该技术每次分离的蛋白数小于100个，差异蛋白的质量范围通常在5KD-20KD之间。

　　5、降低芯片的成本和取消软件每年更新的费用。

　　6、提高真空系统和检测系统的稳定性。

2. 液体芯片-飞行时间质谱技术－CLINPROT系统的组成、原理、分析过程和特点

　　为了满足临床对肿瘤标志物的迫切需求，德国Bruker Daltonics公司于2004年成功的开发了一套CLINPROT系统。该系统可分为四个部分，磁珠分离系统、质谱系统、分析软件和可选的体液样品自动处理系统。基本过程是，患者或健康对照的临床样品，如血清、血浆、尿液、脑脊髓液等，首先通过磁珠分离，去除样品中的高丰度蛋白和其他杂质，如盐等，同时富集了低丰度目的蛋白。分离后得到的样品中加入基质，混合后，直接点在AnchorChip靶上，进行飞行时间质谱分析，得到所有蛋白的质谱图，通过软件比较患者或健康对照的差异表达蛋白，得到两者的特异质谱谱图，用于预测未知样品的归属-患者或无疾病。

　　Bruker Daltonics公司的磁珠纯化系统，具有以下几个特点：

　　一、磁珠颗粒小，仅数个纳米；磁珠的总表面积大；表面的特异基团可与血清中特异低丰度蛋白充分接触，捕获蛋白种类多，从而保证了系统有很好的特异性。在仅一滴血清（10-50μL）中，在分子量范围为0.8-15kDa内，可检测出400多个不同的峰，更多体积的血清样品中可检测出血液中2000种不同的多肽或蛋白_[9]。

　　二、磁珠种类多。根据分离原理可分为：离子交换，如MB-WCX，MB-WAX等；金属鳌合，如MB-IMAC-Fe，MB-IMAC-Cu等；疏水作用，如MB-HIC　C1，MB-HIC　C3，MB-HIC　C8，MB-HIC C18等；以及专门用于标记糖蛋白的磁珠和标记抗体的G蛋白磁珠等，可适用于不同的疾病和蛋白。

　　三、操作简单快捷。只需要几次简单的混匀、冲洗和洗脱过程即可完成前处理，更适于临床检验。

　　四、磁珠系统由于磁珠表面积大，而具有很高重复性_[10]、[11]。

　　五、液体自动处理系统可实现高通量，每天可处理多达3万个样品；

　　六、消耗品价格低，只有同类产品价格的一半左右；

　　七、在质谱系统中，样品靶拥有最新AnchorChip专利技术，因其表面具有疏水作用基团，在中央具有亲水基团，在溶剂蒸发时，样品液滴可收缩锚定至600 μm，可大大增加分析物的浓度，相对常规芯片，提高10-100倍的灵敏度。CLINPROT系统中的质谱的的可测蛋白质量范围是0.01-600kDa，一级TOF可测出含量低至1fmol的蛋白，理论上可测出血清中0.3μg/L 的PSA，是正常人血清中PSA含量的1/3。TOF/TOF灵敏度为1amol，并可对高丰度的蛋白或多肽进行直接鉴定。软件系统能同时比较8种不同疾病组之间的质谱差异表达谱图，差异可通过多种的形式表现，如胶图、堆叠图等_[12]。

3. CLINPROT系统在临床肿瘤早期诊断中的应用

3.1 卵巢癌

　　美国Bruker Daltonics公司的Sergei Dikler和美国哈佛大学医学院的Samuel C. Mok等利用CLINPROT系统研究了早期卵巢癌中的标志物M_[13]。利用WCX磁珠纯化，和TOF/TOF质谱分析，建立了8例Ⅰ期卵巢癌病人和8例健康妇女血清的质谱表达谱图，对健康人的预测灵敏度为100%，对卵巢癌患者检出的正确率为97%。同时鉴定出3个差异显著的峰，质量数分别为：2080.9，2659.2，2681.2。质量数为2659.2的峰为α-纤维蛋白原的片段，质量数为2080.9的峰为激肽原的片段。

3.2 脑胶质瘤和成神经管细胞瘤

　　美国斯隆-凯特琳癌症研究所的Josep Villanueva等对脑胶质细胞瘤诊断的前瞻性研究表明，利用CLINPROT系统中MB HIC 8磁珠分离和液体自动处理机器人操作，经质谱分析，在34个患者和22个正常人的血清中产生了274个差异的峰，用随机的55个样品建立病人和正常人的质谱模型，对正常和病人的诊断的特异性可高达96.4%_[9]。

　　德国Bruker Daltonics的Sau-Mei Leung和美国休斯顿贝勒医学院的M.Sheldon等研究了成神经管细胞瘤相关的标志物。利用MB WCX磁珠，建立了8例成神经管细胞瘤和8例正常人质谱表达谱图，TOF/TOF鉴定了其中一个差异最显著质量数为2080的峰，Mascot搜索表明，它与人激肽原前体同源_[14]。

3.3 头颈鳞癌

　　美国东弗吉尼亚医学院的Lisa H. Cazares利用CLINPROT系统研究了头颈鳞癌的早期标志物。磁珠系统为IMAC Cu2+ 。通过比较24例头颈鳞癌、24例健康吸烟者和27例不吸烟的健康人，在1-10KD的质量范围内，头颈鳞癌患者和不吸烟的健康人之间共发现195个显著差异峰。其中表达升高差异最明显的峰质量数为1469.09，经TOF/TOF鉴定为血纤维蛋白肽A的片段。表达下降最明显的是质量数为5066.40的峰。研究还表明，该系统比Ciphengen公司的IMAC Cu2+芯片具有更高的重复性和在2-5KD之间能发现更多的差异峰_[15]。

3.4 白血病

　　德国汉诺威临床医学研究机构的Elke Schaffeler研究了用于儿童急性淋巴白血病的早期诊断特异峰_[16]。通过疏水作用基团的磁珠（HIC-C8）分离后，经飞行时间质谱仪鉴定，用30个患者和30个健康人的血浆建立了各自的质谱谱图，用17个样品盲法测试，预测的特异性为100%。并找到质量数为2437.7，6457.9，7772.2，9420.5的四个差异蛋白峰，可成为四个潜在的急性淋巴白血病的生物标志物。目前在德国，该技术平台已用于儿童急性淋巴白血病的早期辅助诊断。

3.5 前列腺癌、乳腺癌_[17]、膀胱癌_[18]

　　美国斯隆-凯特琳癌症研究所的Paul Tempst等利用CLINPROT系统研究了32例前列腺癌、21例乳腺癌和20例膀胱癌。以33例健康人为对照，发现了651个差异表达的峰，其中的有14个、10个和58个可分别作为前列腺癌、乳腺癌和膀胱癌的肿瘤标志物，同时对这些标志物都进行了质谱的序列分析。对41例前列腺癌患者的血清的盲性测试表明，它的预测准确率为100%。进一步对其中高离子丰度的47个峰的TOF/TOF或Q-TOF研究表明，这些峰包括了血纤维蛋白肽A、补体C3f和血管舒缓激肽系统的全部的19个蛋白。其中，大部分的差异表达峰是由于血液在体外凝固过程中，由于肿瘤患者和正常人之间蛋白酶表达差异，从而产生不同的酶解片段而引起的。

　　美国科罗拉多大学的Rodriguez等利用CLINPROT系统研究了前列腺癌相关的PSA水平高低的标志物。磁珠系统为IMAC Cu2+ 。分析了65例PSA水平大于2.5ng/ml和65例PSA水平小于0.5ng/ml的美国黑人之间，血清蛋白质谱表达模式，发现了10个峰有显著的差异。

　　综上所述，临床上肿瘤的高发生率和死亡率迫切需要新的早期诊断用的生物标记物。蛋白质组技术的飞速发展给它的发现和鉴定带来了新的机遇。液体芯片激光解吸电离飞行时间质谱技术-CLINPROT系统，具有重复性好，特异性和灵敏度高并可对潜在的生物标记物进行鉴定的强大的优势。目前，已经在卵巢癌、前列腺癌、脑胶质瘤、急性淋巴白血病、乳腺癌和膀胱癌等的早期诊断进行了早期的前瞻性研究。相信，随着CLINPROT系统的不断发展和应用，会有更多的肿瘤早期生物标志物得到发现和鉴定，为全世界肿瘤患者带来福音和希望。

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