结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法的建立与应用

       【摘要】  目的 建立结核分枝杆菌的荧光定量PCR检测方法，探讨荧光 PCR检测痰标本中结核分枝杆菌的应用价值。方法 根据结核分枝杆菌基因保守序列设计引物和探针，并构建标准品。对102例培养涂阳的结核痰液标本和45例非结核感染者的痰标本，应用荧光定量PCR法、痰涂片抗酸染色法检测结核分枝杆菌。结果 荧光定量 PCR、抗酸染色法检测结核分枝杆菌的特异性分别为100%、30%。结论 荧光定量PCR是一种快速、敏感性高、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法，具有重要的应用价值。

       【关键词】  结核；分枝杆菌；抗酸染色；荧光定量PCR

       结核病是严重危及全球的公共卫生问题之一，自1985年以来结核病疫情在全球范围内急剧上升，据世界卫生组织报道，目前全球有近1/3的人感染了结核杆菌，即20亿人口感染了结核杆菌，其中活动性肺结核病人约2 000万，每年新增结核病人约800～1 000万，每年约有300万人死于结核病［1～3］。结核病已成为导致全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一。我国是全球22个结核病高发国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。据2000年全国结核病流行病学抽样调查估计，全国现有活动性肺结核病人450万，其中传染性肺结核病人150万［4］。结核病防治是我国乃至全球疾病防治的重要课题。目前，出入境人员体检诊断传染性肺结核的主要方法是通过胸部X片检查，加上痰涂片抗酸染色镜检和PPD试验联合检测。由于胸部X片是根据临床症状进行诊断，缺乏病原学依据，加上肺结核与其他肺部疾病在胸片上有相似的地方，容易出现误诊和漏诊；痰涂片抗酸染色的阳性率低，采样不合格标本的阳性率更低，极易出现漏诊；而PPD试验的特异性不强，不能作为确诊肺结核的依据。因此，这三种检测方法的组合模式在检测肺结核上存在着较大的缺陷，易导致传染性肺结核病人的漏诊，而少数肺部疾病或其他部位结核的病人可能出现误诊，降低了出入境人员传染性肺结核监测的效果。分子生物学方法以其简便、快速，特异性高的特点成为结核分枝杆菌检测研究的热点。国内外大量研究证明PCR检测结核分枝杆菌敏感性达到100％，本研究以荧光PCR技术为基础，开发适合传染性肺结核快速诊断模式，结果报告如下。

       1、材料与方法

       1.1  材料

       确诊肺结核病人培养涂阳的结核痰液标本102份。正常人的痰液25份，葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯球菌痰液标本共计20份。

       1.2  引物与探针

       根据对NCBI数据库结核杆菌基因序列分析，找出其保守序列，并且在此区域应用Primer5.0 和Primer express 3.0软件设计引物与探针，探针的5’端标以荧光发射基团FAM标记，靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA标记 (表1) 。Forward Primer：5’TAGGCGTCGGTGACAAAGG3’；Reverse Primer：5’GGGTAGCAGACCTCACCTATGTG3’；Probe：5’CACGTAGGCGAACCCTGCCCA3’。

       1.3  仪器

       ABI公司的ABI7500荧光Real－time PCR仪。

       1.4  痰液DNA提取

       1.4.1  痰液样品的预处理

       吸取待测痰液200μl放入1.5ml的eppendo管中，加入5mol/L NaOH 500μl，混匀，室温中摇动20min。加入1mol/L NaH2PO4 700μl，混匀(起中和作用)，10 000rmp离心5min。去上清液，补加TE至100μl，混匀，加入20μl浓度为50mg/ml的溶菌酶。置37℃消化30min。

       1.4.2  DNA的提取

       细胞复合裂解液置65℃水浴中，使其中的结晶溶解。将300μl结晶已溶解的细胞复合裂解液加入到上述预处理好的痰液样品中，混璇器震荡混匀20秒，置65℃水浴中反应20min。加入200μl蛋白沉淀液，上下颠倒5～6次使两者混匀。16 000rmp离心3min。将上清液(约500μl)转移至新的离心管中，加入等体积异丙醇，此时可见透明的絮状物，混匀后16 000rmp离心3min，倾去上清。加入200μl 70％的乙醇溶液，来回倒置，清洗管壁，16 000rmp离心3min。吸去70％乙醇，倒置离心管于干净的滤纸上，乙醇挥发完全，加入30μl DNA溶解液，快速漩涡震荡1～2秒，使沉淀的DNA完全溶解。