免疫组织化学实验操作顺序

1. 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(PH7.4)冲洗三次，每次5分钟。

PBS配制 （2000ml）PH7.4

氯化钠： 17g

磷酸二氢钠：0.4g

磷酸氢二钠：6.3g

2. 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。

我采用压力锅进行抗原修复，取一定量的修复液于压力锅中，加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，从喷气开始计时，2分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温（也可以稍冷后，在自来水龙头下加速冷却）。取出玻片，先用蒸馏水冲洗两遍（用蜡在组织周围划圈，防止抗体跑散，但圈要大一点），之后用PBS（PH7.4）冲洗三遍。每次5分钟。

柠檬酸缓冲液的配制（PH6.0）

0.1M柠檬酸：（4.2g+200ml蒸馏水）

0.1M柠檬酸三钠 （14.7g+500ml蒸馏水）

取柠檬酸三钠41ml+柠檬酸9ml加入450ml蒸馏水中，总量为500ml即可。

3. 配制3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，孵育十分钟。

PBS90 ml+30 %过氧化氢10 ml，现用现配并摇匀，盖上盖子，防止见氧分解挥发。

4. PBS 冲洗三次，每次5分钟。

5. 滴加4 %羊血清封闭，室温30分钟，以减少非特异性染色。

PBS 10 ml+正常羊血清400 ul

6. 甩去羊血清，根据不同的项目配制并滴加不同的一抗，浓缩型的抗体一定要在购买后先用已知的阳性片做梯度实验，根据结果情况找出最佳稀释浓度再用到临床诊断。

工作液也应该在购买后先用已知的阳性片检测抗体的染色效果，直接滴加即可。每次还应带上阳性对照和阴性对照，以保证结果的可靠性。每张切片滴加足够量的一抗并放入湿盒，防止切片干燥影响结果，室温孵育2小时。

抗体稀释液的配制 牛血清白蛋白：2mg

叠氮钠： 10～20ml

双蒸水： 10ml

7 . PBS冲洗三次，每次5分钟。

8. 滴加二步法EnVision TM孵育30分钟。

9. PBS冲洗三次，每次5分钟。

10. 甩去PBS液，每张切片滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下观察，阳性信号为棕黄色或棕褐色。一般显色时间为5分钟左右，终止反应，自来水充分冲洗。

11. 苏木素复染，0.1%盐酸酒精分化，氨水返兰或自来水返兰（自来水返兰时间要稍长些，应该在显微镜下看以下苏木素复染情况），自来水冲洗。

12. 梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，阅片并总结染色结果。