【交流】胶体金试纸-标准实验操作指南 step by step
丁香园
3079
<font>序</font>
在海外学习的日子里，经常收到丁香园战友邮件，询问胶体金试纸的实验操作问题。于是计划编写一本标准实验操作指南，将实验过程以step by step方式呈现出来，方便战友们参考和开展实验。力求使用简单、明确的表达方式，达到看完就能开展实验的目的。同时希望大家就该指南提出宝贵意见和补充信息。另，我的英文名已改为Binz Smith，有兴趣的战友，可以在linkedin或facebook上找到我。
<font>一，实验准备：</font>
1. 仪器及用途：
biodot XYZ3060，定量喷点C/T线及胶体金溶液
电磁加热搅拌套式恒温器+洄流圆形烧瓶+蛇型冷凝管+搅拌子，烧金
分光光度计，测定金颗粒质量
高速冷冻离心机，标记过程用
烘箱（25度-65度），膜烘干
切条机，biodot CM4000
除湿机，干燥度20%
封口机，试纸保存
2. 耗材：
NC膜，whatman FF120 或 AE99
吸水纸，进口国产皆可
胶体金垫，聚酯膜 whatman Standard 14&17，或者 Ahlstrom 6613
样品垫，玻璃纤维whatman 33 glass，或者 Ahlstrom 8964
PVC背板，国产进口皆可
3. 试剂：
HAuCL4（进口，sigma），制金原料
柠檬酸三钠，制金原料
二氯二甲硅烷+氯仿，清洁制金玻璃容器试剂
BSA（进口，巴斯夫或sigma），标记添加剂
PEG 20000，标记添加剂
精密pH试纸（whatman），标记溶液PH调节
各种普通化学药品，表面活性剂，缓冲溶液若干
4. 抗原抗体材料，自备
<font>二，抗原抗体的前处理和保存</font>
1. 腹水的纯化：饱和硫酸铵沉淀法或辛酸沉淀法, 然后过亲和层析柱（必须）。
2. 蛋白浓缩：冷冻抽干，或透析
3. 蛋白的测定：
1）纯度测定，跑Pag胶，测定条带大小及完整性，看是否有杂带析出。
2）浓度测定，分光光度计使用280nm，260nm波长测OD。
4. 蛋白保存：
1）将大容量的抗体分装成大瓶和小瓶两种，以免反复冻融和避免污染，可加0.05%叠氮钠防腐。
2）短期保存，4度低温冷藏，蛋白活性可保持数周。
3）长期保存，-70度低温冷冻. 注意复融时，请遵守（-70度）至（-20度）至（-4度或0度）至（常温）的多级降温程序。温度跨度过大容易失活，产生蛋白沉淀。
5. 标记前处理：
1） 离心去杂质沉淀
2） 如蛋白是使用饱和硫酸铵沉淀法等盐法提纯，需使用2mM硼酸PH9.0或者是10mM的PB缓冲溶液PH7.4进行透析，将溶液内的盐充分透析出, 盐将影响标记效果。
<font>三，金溶液制作</font>
1. 玻璃容器的清洁
玻璃表面的污染会干扰金颗粒的生成，所有玻璃容器使用前经过酸洗硅化。
方法是将初次使用的玻璃容器浸泡于５％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中１分钟，室温干燥后蒸馏水冲洗，再干燥备用。反复使用的器皿以金溶液润洗后双蒸馏水淋洗，代替硅化处理。
2. 金颗粒制备
注意：该以下过程为化学反应，金颗粒效果取决于化学原料的质量，请使用进口药品。
原材料：
1% HAuCL4（sigma） 溶液
HAuCL4易受潮且对金属有强腐蚀性，因此称量时，勿用金属药匙，避免接触天平称盘。稀释方式为双蒸馏水（电阻率18.2左右），其溶液在４℃可稳定数月。
1% 柠檬酸三钠溶液（sigma），需新鲜制备，然后0.22um滤膜过滤
仪器： 电磁加热搅拌套式恒温器+洄流圆形烧瓶+蛇型冷凝管+搅拌子
方法：
1) 取99 ml ddH2O于洄流圆底烧瓶中，加入1ml 1% HAuCL4溶液，混匀。
2) 洄流圆底烧瓶置于电热套式恒温器中，加入干净搅拌子，低速搅拌并加热沸腾。
3) 迅速一次性加入1ml 1% 柠檬酸三钠溶液，继续煮沸。
4) 观察溶液颜色变化，由浅黄→黑色→紫色→紫红色，当完全变为紫红色时，继续洄流10分钟。
5) 停止加热，冷却至室温。
注意：可通过调整柠檬酸三钠溶液的加入量，来控制金颗粒大小。
3. 金颗粒检测
仪器：分光光度计
方法：
1）设定500-550 nm扫描。
2）用ddH2O调零，后取金溶液，在500~550nm之间扫描吸收值。
3）要求在532nm±2nm（40nm）522nm±2nm（30nm）附近有最高吸收峰。
4. 金溶液pH调节
1) 配制1%K2CO3溶液
2) 用1%K2CO3调节金溶液pH至8.2（单抗标记），可调范围7.4-9.0。最佳标记PH以NaCL滴定法判断。
方法：滴加K2CO3到金溶液，边加边搅拌，whatman精密pH试纸检测到溶液pH值至8.2左右。如用pH计检测，则需精密防腐蚀电极，注意普通电极易吸附金颗粒导致堵塞损坏。
补充观点：
沧海一粟8312：个人觉得还是不要用pH试纸，因为这个靠肉眼判断肯定会有色差，以后批间差会很大。我觉得好的方法还是比如1ml的金水中加入2ul的0.1M k2co3的量，当然这个k2co3的量可自行调试，可以多弄几个梯度看看，关键还是看哪个用量是最佳的，然后放大。
<font>四，抗体的金标记</font>
1. 标记
标记量：双抗体夹心法10-20ug/ml，竞争法1-5ug/ml
1） 量取100ml金溶液，逐滴加入1mg抗体溶液，搅拌30分钟。
2） 取10% BSA, 逐滴加入混合溶液，至终浓度0.5%，搅拌15分钟。BSA作用为封闭非特异性位点和增加稳定性。
3） 取5% PEG(20 000)，逐滴加入混合溶液，至终浓度0.1%，搅拌15分钟。
2. 离心纯化
仪器： 高速冷冻离心机，
操作步骤
1）离心，速度8000-9000RPM，4℃，1小时
2）悬浮沉淀弃上清，后加入稀释液混匀。 稀释比例根据原液量换算，例100ml原液，沉淀稀释到10-20ml。Buffer （pH7.2-8.2）可用PBS等。
3. 金标抗体的检测
仪器：分光光度计
检测：
1）以稀释液为空白对照
2）扫描金标抗体在500~550nm间吸收值，抗体标记后峰值变化3-5nm.
注意：标记溶液应即标即用，不宜长期存储。
<font>五，胶体金垫与样品垫的预处理</font>
1. 确定处理数量，A4纸张（或裁切成其他规格），每10张一叠放置。
2. 配置缓冲液（约30ml/A4纸张大小）。因材料厚薄和性能略有差异，处理液量需灵活调节。处理液配方请根据具体产品准备，基本元素：缓冲buffer+NaCl+表面活性剂+大蛋白（BSA, Casein）+其他。
3. 带手套, 将材料放入缓冲液完全浸透，浸泡10min，后取出脱水3min，平置在筛网上.
4. 放入37℃干燥箱（湿度小于20%），烘干至湿度恒定在20%左右。
5. 将烘干后材料装入铝箔袋或塑料袋中密封保存，贴标签及记录批号，注意处理好的玻璃纤维不能长期暴露在湿度高的环境。注意，使用前要弃除四个材料边缘，因有边缘效应。
<font>六，点样</font>
1. 胶体金喷点到胶体金垫
1）稀释标记胶体金至5 OD/ul（浓度可自行调节），添加(终浓度): 10-20%蔗糖，1-3%BSA，0.5-1% NaCl, 0.5-1%表面活性剂.
2) 在湿度20－40％, 室温条件下，将溶液用BIODOT仪器的AIRJET喷头喷到胶体金垫上，压力设置为10 PSI，喷点参数为 2-6 ul/cm。
3) 将喷好的胶体金条带置于37℃干燥, 湿度恒定在20%后，收起并密封贮存。
4) 使用时切割整条条带即可，注意金条带两端边缘要弃除，因有边缘效应。
2. 抗原/抗体喷点到NC膜
1) 取出NC膜，在室温和正常湿度下平衡1小时。
2) 用缓冲溶液将抗原/抗体稀释到合适浓度（0.1-5mg/ml），缓冲系统可选磷酸盐, Tris, 碳酸盐；pH范围：6.0-9.0(根据等电点而定)，另加1%NaCl ，1%蔗糖，表面活性剂若干。
3) 使用BIODOT仪器，设定喷点量为0.5-1ul/cm，并点样。
4) 烘箱干燥，37度2小时至湿度20%以下，后密封包装待用。
注意：NC膜点样前不做任何处理。
<font>七，试纸条的组装、剪切、包装（环境要求：常温，20%湿度以下）</font>
1. 将NC膜非点样面粘贴于PVC底板.
2. 胶体金垫粘贴在NC膜的下方，覆盖NC膜1mm.
3. 吸水垫粘贴在NC膜的上方，覆盖NC膜2mm。
4. 样品垫粘贴在胶体金垫的下方，覆盖胶体金垫2mm
5. 在BIODOT，CM剪切机中将粘贴好的检测板剪切成4mm宽的条。
6. 装壳并和干燥剂一并装入铝箔袋，密封后贴上标签
<font>后记</font>
该文章的目的是建立胶体金试纸的基本工作流程，所以在应用上具有一定的局限性。希望大家在这个基础上添砖加瓦，不断将该流程丰富起来，使其成为一个更加完整的SOP操作指南。
（全文完）Binz Smith, in Perth, Australia. Nov 2012.
在海外学习的日子里，经常收到丁香园战友邮件，询问胶体金试纸的实验操作问题。于是计划编写一本标准实验操作指南，将实验过程以step by step方式呈现出来，方便战友们参考和开展实验。力求使用简单、明确的表达方式，达到看完就能开展实验的目的。同时希望大家就该指南提出宝贵意见和补充信息。另，我的英文名已改为Binz Smith，有兴趣的战友，可以在linkedin或facebook上找到我。
<font>一，实验准备：</font>
1. 仪器及用途：
biodot XYZ3060，定量喷点C/T线及胶体金溶液
电磁加热搅拌套式恒温器+洄流圆形烧瓶+蛇型冷凝管+搅拌子，烧金
分光光度计，测定金颗粒质量
高速冷冻离心机，标记过程用
烘箱（25度-65度），膜烘干
切条机，biodot CM4000
除湿机，干燥度20%
封口机，试纸保存
2. 耗材：
NC膜，whatman FF120 或 AE99
吸水纸，进口国产皆可
胶体金垫，聚酯膜 whatman Standard 14&17，或者 Ahlstrom 6613
样品垫，玻璃纤维whatman 33 glass，或者 Ahlstrom 8964
PVC背板，国产进口皆可
3. 试剂：
HAuCL4（进口，sigma），制金原料
柠檬酸三钠，制金原料
二氯二甲硅烷+氯仿，清洁制金玻璃容器试剂
BSA（进口，巴斯夫或sigma），标记添加剂
PEG 20000，标记添加剂
精密pH试纸（whatman），标记溶液PH调节
各种普通化学药品，表面活性剂，缓冲溶液若干
4. 抗原抗体材料，自备
<font>二，抗原抗体的前处理和保存</font>
1. 腹水的纯化：饱和硫酸铵沉淀法或辛酸沉淀法, 然后过亲和层析柱（必须）。
2. 蛋白浓缩：冷冻抽干，或透析
3. 蛋白的测定：
1）纯度测定，跑Pag胶，测定条带大小及完整性，看是否有杂带析出。
2）浓度测定，分光光度计使用280nm，260nm波长测OD。
4. 蛋白保存：
1）将大容量的抗体分装成大瓶和小瓶两种，以免反复冻融和避免污染，可加0.05%叠氮钠防腐。
2）短期保存，4度低温冷藏，蛋白活性可保持数周。
3）长期保存，-70度低温冷冻. 注意复融时，请遵守（-70度）至（-20度）至（-4度或0度）至（常温）的多级降温程序。温度跨度过大容易失活，产生蛋白沉淀。
5. 标记前处理：
1） 离心去杂质沉淀
2） 如蛋白是使用饱和硫酸铵沉淀法等盐法提纯，需使用2mM硼酸PH9.0或者是10mM的PB缓冲溶液PH7.4进行透析，将溶液内的盐充分透析出, 盐将影响标记效果。
<font>三，金溶液制作</font>
1. 玻璃容器的清洁
玻璃表面的污染会干扰金颗粒的生成，所有玻璃容器使用前经过酸洗硅化。
方法是将初次使用的玻璃容器浸泡于５％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中１分钟，室温干燥后蒸馏水冲洗，再干燥备用。反复使用的器皿以金溶液润洗后双蒸馏水淋洗，代替硅化处理。
2. 金颗粒制备
注意：该以下过程为化学反应，金颗粒效果取决于化学原料的质量，请使用进口药品。
原材料：
1% HAuCL4（sigma） 溶液
HAuCL4易受潮且对金属有强腐蚀性，因此称量时，勿用金属药匙，避免接触天平称盘。稀释方式为双蒸馏水（电阻率18.2左右），其溶液在４℃可稳定数月。
1% 柠檬酸三钠溶液（sigma），需新鲜制备，然后0.22um滤膜过滤
仪器： 电磁加热搅拌套式恒温器+洄流圆形烧瓶+蛇型冷凝管+搅拌子
方法：
1) 取99 ml ddH2O于洄流圆底烧瓶中，加入1ml 1% HAuCL4溶液，混匀。
2) 洄流圆底烧瓶置于电热套式恒温器中，加入干净搅拌子，低速搅拌并加热沸腾。
3) 迅速一次性加入1ml 1% 柠檬酸三钠溶液，继续煮沸。
4) 观察溶液颜色变化，由浅黄→黑色→紫色→紫红色，当完全变为紫红色时，继续洄流10分钟。
5) 停止加热，冷却至室温。
注意：可通过调整柠檬酸三钠溶液的加入量，来控制金颗粒大小。
3. 金颗粒检测
仪器：分光光度计
方法：
1）设定500-550 nm扫描。
2）用ddH2O调零，后取金溶液，在500~550nm之间扫描吸收值。
3）要求在532nm±2nm（40nm）522nm±2nm（30nm）附近有最高吸收峰。
4. 金溶液pH调节
1) 配制1%K2CO3溶液
2) 用1%K2CO3调节金溶液pH至8.2（单抗标记），可调范围7.4-9.0。最佳标记PH以NaCL滴定法判断。
方法：滴加K2CO3到金溶液，边加边搅拌，whatman精密pH试纸检测到溶液pH值至8.2左右。如用pH计检测，则需精密防腐蚀电极，注意普通电极易吸附金颗粒导致堵塞损坏。
补充观点：
沧海一粟8312：个人觉得还是不要用pH试纸，因为这个靠肉眼判断肯定会有色差，以后批间差会很大。我觉得好的方法还是比如1ml的金水中加入2ul的0.1M k2co3的量，当然这个k2co3的量可自行调试，可以多弄几个梯度看看，关键还是看哪个用量是最佳的，然后放大。
<font>四，抗体的金标记</font>
1. 标记
标记量：双抗体夹心法10-20ug/ml，竞争法1-5ug/ml
1） 量取100ml金溶液，逐滴加入1mg抗体溶液，搅拌30分钟。
2） 取10% BSA, 逐滴加入混合溶液，至终浓度0.5%，搅拌15分钟。BSA作用为封闭非特异性位点和增加稳定性。
3） 取5% PEG(20 000)，逐滴加入混合溶液，至终浓度0.1%，搅拌15分钟。
2. 离心纯化
仪器： 高速冷冻离心机，
操作步骤
1）离心，速度8000-9000RPM，4℃，1小时
2）悬浮沉淀弃上清，后加入稀释液混匀。 稀释比例根据原液量换算，例100ml原液，沉淀稀释到10-20ml。Buffer （pH7.2-8.2）可用PBS等。
3. 金标抗体的检测
仪器：分光光度计
检测：
1）以稀释液为空白对照
2）扫描金标抗体在500~550nm间吸收值，抗体标记后峰值变化3-5nm.
注意：标记溶液应即标即用，不宜长期存储。
<font>五，胶体金垫与样品垫的预处理</font>
1. 确定处理数量，A4纸张（或裁切成其他规格），每10张一叠放置。
2. 配置缓冲液（约30ml/A4纸张大小）。因材料厚薄和性能略有差异，处理液量需灵活调节。处理液配方请根据具体产品准备，基本元素：缓冲buffer+NaCl+表面活性剂+大蛋白（BSA, Casein）+其他。
3. 带手套, 将材料放入缓冲液完全浸透，浸泡10min，后取出脱水3min，平置在筛网上.
4. 放入37℃干燥箱（湿度小于20%），烘干至湿度恒定在20%左右。
5. 将烘干后材料装入铝箔袋或塑料袋中密封保存，贴标签及记录批号，注意处理好的玻璃纤维不能长期暴露在湿度高的环境。注意，使用前要弃除四个材料边缘，因有边缘效应。
<font>六，点样</font>
1. 胶体金喷点到胶体金垫
1）稀释标记胶体金至5 OD/ul（浓度可自行调节），添加(终浓度): 10-20%蔗糖，1-3%BSA，0.5-1% NaCl, 0.5-1%表面活性剂.
2) 在湿度20－40％, 室温条件下，将溶液用BIODOT仪器的AIRJET喷头喷到胶体金垫上，压力设置为10 PSI，喷点参数为 2-6 ul/cm。
3) 将喷好的胶体金条带置于37℃干燥, 湿度恒定在20%后，收起并密封贮存。
4) 使用时切割整条条带即可，注意金条带两端边缘要弃除，因有边缘效应。
2. 抗原/抗体喷点到NC膜
1) 取出NC膜，在室温和正常湿度下平衡1小时。
2) 用缓冲溶液将抗原/抗体稀释到合适浓度（0.1-5mg/ml），缓冲系统可选磷酸盐, Tris, 碳酸盐；pH范围：6.0-9.0(根据等电点而定)，另加1%NaCl ，1%蔗糖，表面活性剂若干。
3) 使用BIODOT仪器，设定喷点量为0.5-1ul/cm，并点样。
4) 烘箱干燥，37度2小时至湿度20%以下，后密封包装待用。
注意：NC膜点样前不做任何处理。
<font>七，试纸条的组装、剪切、包装（环境要求：常温，20%湿度以下）</font>
1. 将NC膜非点样面粘贴于PVC底板.
2. 胶体金垫粘贴在NC膜的下方，覆盖NC膜1mm.
3. 吸水垫粘贴在NC膜的上方，覆盖NC膜2mm。
4. 样品垫粘贴在胶体金垫的下方，覆盖胶体金垫2mm
5. 在BIODOT，CM剪切机中将粘贴好的检测板剪切成4mm宽的条。
6. 装壳并和干燥剂一并装入铝箔袋，密封后贴上标签
<font>后记</font>
该文章的目的是建立胶体金试纸的基本工作流程，所以在应用上具有一定的局限性。希望大家在这个基础上添砖加瓦，不断将该流程丰富起来，使其成为一个更加完整的SOP操作指南。
（全文完）Binz Smith, in Perth, Australia. Nov 2012.
