【原创】Western blot 实验心得 step by step
丁香园论坛
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根据自己的实验体会,总结做好WB的一些心得,与大家分享,不当之处欢迎批评指正。叙述的思路就是围绕着实验的每个步骤展开,这样可能更具体些。
1.配胶: 该部分较为重要的是配制凝胶时要充分混匀,此外应保证试剂的新鲜。
常出现的问题有:A.凝胶出现花纹:此时应检查原料中过硫酸铵(AP)粉末是否受潮
B.凝胶聚合时间较长:聚合时间由AP以及TEMED决定,通常在30min左右,AP不新鲜会导致聚合变慢:此外还需注意环境的温度也很重要,气温较低时胶是会凝得慢一些,必要时可适当增加AP以及TEMED的量,但通常不会超过1h,若超过1h甚至更长仍未聚合,应检查配制的操作有无错误。
2.处理蛋白样品:该部分蛋白样品本身很关键,若蛋白提取过程存在问题或蛋白发生降解则很难进行好之后的实验,也就很难做出好的结果了;除此之外loading buffer的作用也不容忽视,切莫使用不新鲜的上样缓冲液,同时在处理时将样品与loading buffer混合均匀也应注意。
3.电泳:首先在跑积层胶时应尽可能使样品压齐,若上样量较大(如细胞蛋白通常上样在20-30甚至40ul),可适当减小电压跑20-30min,待压齐后方可开始分离。
4.转膜:该环节电流的大小,转膜的时间决定是否能成功将蛋白转上,而具体的参数应取决于所要蛋白的分子量大小,应反复摸索,本人在实验中得出的经验为:10KDa:200mA 1h; 60KDa 70V,2h;90KDa 70V,4h;200KDa 70V,6h. 此外还有如下几个细节问题需要注意:
A.膜的选择:PVDF还是NC,0.22μm还是0.45μm
B.转膜液中甲醇的量:通常在10%-20%,蛋白分子量较大时可适当减少,蛋白分子量小时应适当增加,建议先从15%开始。
5.封闭:该步骤一般不易出现问题,常见的有室温2-3h,或者4度封闭过夜,但仍需强调一点的是有些抗体的使用需配套使用特殊的封闭液。
6.一抗孵育:通常购买到一种新抗体后,还是建议先按说明书推荐的浓度比例在室温孵育2-3h, 若该抗体效价较好,应该显带很漂亮,尤其是在抗体刚买时间不长,然而事情往往不能尽如人意,我们在遇到一个不好的抗体时该怎么办?可通过延长孵育时间(如:4度过夜孵育甚至室温过夜孵育),增大抗体浓度,如果你想尽了一切可能结果仍然很不理想,建议还是换抗体吧,不要再浪费时间与精力了。
7.洗膜: 个人认为洗膜液洗3遍,每遍10min足以,没有必要过多次数过长时间,膜的背景不好很多时候并不是没洗干净,更多的应该去考虑抗体浓度是否过高等其他原因,本人实验过程中曾经做过两个抗体,其他的条件一样(甚至是从一张膜上剪开的),背景却相差很大,你能说是没洗干净吗?洗二抗同样如此
8.二抗孵育:选择好一个合适的条件不要轻易改变,另外相比一抗,二抗作用的时间应严格控制,实践证明一抗时间长点可能没什么关系,而二抗时间若过长过短都将会直接影响结果。
9.扫膜:本人的实验室使用的是odyssey机器,该机器及相应软件操作简便,使用起来也很智能,这里就不多说了。
以上是本人在实验过程中不断总结得出的一点小小体会,没有华丽的语言,没有高深的理论,只是希望能对刚刚接触western blot实验的朋友有点帮助,可能真正接触了实验后才能更好的去思考去总结,其实不只是western blot,可以说很多实验真的是细节决定成败,也许当我们认真做好每一个环节好的结果自然就水到渠成了,还是做个有心人吧,天才来自勤奋,成功源于积累!有什么新的心得体会,我将会及时补充,同时也希望各位战友批评指正!
1.配胶: 该部分较为重要的是配制凝胶时要充分混匀,此外应保证试剂的新鲜。
常出现的问题有:A.凝胶出现花纹:此时应检查原料中过硫酸铵(AP)粉末是否受潮
B.凝胶聚合时间较长:聚合时间由AP以及TEMED决定,通常在30min左右,AP不新鲜会导致聚合变慢:此外还需注意环境的温度也很重要,气温较低时胶是会凝得慢一些,必要时可适当增加AP以及TEMED的量,但通常不会超过1h,若超过1h甚至更长仍未聚合,应检查配制的操作有无错误。
2.处理蛋白样品:该部分蛋白样品本身很关键,若蛋白提取过程存在问题或蛋白发生降解则很难进行好之后的实验,也就很难做出好的结果了;除此之外loading buffer的作用也不容忽视,切莫使用不新鲜的上样缓冲液,同时在处理时将样品与loading buffer混合均匀也应注意。
3.电泳:首先在跑积层胶时应尽可能使样品压齐,若上样量较大(如细胞蛋白通常上样在20-30甚至40ul),可适当减小电压跑20-30min,待压齐后方可开始分离。
4.转膜:该环节电流的大小,转膜的时间决定是否能成功将蛋白转上,而具体的参数应取决于所要蛋白的分子量大小,应反复摸索,本人在实验中得出的经验为:10KDa:200mA 1h; 60KDa 70V,2h;90KDa 70V,4h;200KDa 70V,6h. 此外还有如下几个细节问题需要注意:
A.膜的选择:PVDF还是NC,0.22μm还是0.45μm
B.转膜液中甲醇的量:通常在10%-20%,蛋白分子量较大时可适当减少,蛋白分子量小时应适当增加,建议先从15%开始。
5.封闭:该步骤一般不易出现问题,常见的有室温2-3h,或者4度封闭过夜,但仍需强调一点的是有些抗体的使用需配套使用特殊的封闭液。
6.一抗孵育:通常购买到一种新抗体后,还是建议先按说明书推荐的浓度比例在室温孵育2-3h, 若该抗体效价较好,应该显带很漂亮,尤其是在抗体刚买时间不长,然而事情往往不能尽如人意,我们在遇到一个不好的抗体时该怎么办?可通过延长孵育时间(如:4度过夜孵育甚至室温过夜孵育),增大抗体浓度,如果你想尽了一切可能结果仍然很不理想,建议还是换抗体吧,不要再浪费时间与精力了。
7.洗膜: 个人认为洗膜液洗3遍,每遍10min足以,没有必要过多次数过长时间,膜的背景不好很多时候并不是没洗干净,更多的应该去考虑抗体浓度是否过高等其他原因,本人实验过程中曾经做过两个抗体,其他的条件一样(甚至是从一张膜上剪开的),背景却相差很大,你能说是没洗干净吗?洗二抗同样如此
8.二抗孵育:选择好一个合适的条件不要轻易改变,另外相比一抗,二抗作用的时间应严格控制,实践证明一抗时间长点可能没什么关系,而二抗时间若过长过短都将会直接影响结果。
9.扫膜:本人的实验室使用的是odyssey机器,该机器及相应软件操作简便,使用起来也很智能,这里就不多说了。
以上是本人在实验过程中不断总结得出的一点小小体会,没有华丽的语言,没有高深的理论,只是希望能对刚刚接触western blot实验的朋友有点帮助,可能真正接触了实验后才能更好的去思考去总结,其实不只是western blot,可以说很多实验真的是细节决定成败,也许当我们认真做好每一个环节好的结果自然就水到渠成了,还是做个有心人吧,天才来自勤奋,成功源于积累!有什么新的心得体会,我将会及时补充,同时也希望各位战友批评指正!
版主fangweibin119留言:
经验挺丰富
值得学习
希望楼主继续把一些小的细节能整理发上来
经验挺丰富
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希望楼主继续把一些小的细节能整理发上来