免疫荧光组化技术
丁香园论坛
3461
免疫荧光组化技术
一、荧光的特征
分子都含有电子，电子在不停地运动着。根据量子理论，运动着的电子可以处于一系列不连续的能量状态中，电子遵守一定的规则，要以从一个能级向另一能级跃迁，并伴随着与能级差相对应的特定能量的吸收或释放。
激发 当电子吸收能量跃迁到较高能级，
这个过程叫激发。
发射 以辐身方式跃迁时，能量转化成相
应波长的光，这个过程叫发射。
荧光 跃迁到激发态的电子，大多处于单重激发态。如果电子直接从单重激发态以辐身方式跃迁到基态，由于单重激发态很不稳定，半衰期很短，发射持续的时间也很短，这种发射光，叫荧光。
二、荧光素
能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光色素，必须具备：吸收激发光的光能并发射荧光。
1、具备用于标记抗体的荧光素条件
(1)应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基团，结合后不易离解，而未结合的色素及其降解产物易排除。
(2)荧光效率高，与蛋白质结合后荧光
素质量下降不多。
(3)标记后对抗体的免疫学性质和生化
性质无影响。
(4)结合方法简便而快速，并且较稳定。
2.荧光素的种类
(1)异硫氰酸荧光黄（FITC）：分子量390D，最大吸收光谱为490～495nm，最大发射光谱为520～530nm。呈现明亮的黄绿色荧光，分子量389.4。
(2)四甲基异硫氰酸罗达明（TRITC）是罗达明的衍生物，易溶于水，最大吸收光谱为550nm，最大发射光谱为620nm，呈橙红色荧光。
(3)四乙基罗达明(RB200) 呈褐红色粉末状，溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光谱570nm，最大发射光谱596～600nm，呈明亮橙红色荧光，分子量580，RB200不能直接和蛋白质结合，要先经五氯化磷反应，转化成硫酰氯，再与蛋白质的氨基结合。
(4)1-二甲基氨基-5-硫酰氯
(5)4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪（SITS）
(6)得克萨斯红（Texas red）
(7)藻红蛋白（PE）
(8)花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5）
三、荧光素标记抗体的方法
(一)FITC标记抗体的方法
1.Marsshall法
(1)原理：当FITC在碱性溶液中与抗体反应时，主要是抗体分子上的赖氨酸å -氨基与FITC上硫碳胺键结合，一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个。
(2)操作流程
抗体与荧光素比例为50-100:1
抗体的准备：20mg/ml，碳酸盐缓冲液为总
量的1/10。
荧光素的准备：用分析天平准确称取
0.01mgFITC/1mg抗体。
结合：边搅拌边将称取的荧光素加入抗体
溶液中。
透析
过柱 Sephade×G50或 G25
保存 4℃ -40℃等量甘油分装保存。
2.Chadwick法
3.改良法
4.透析标记法
（二）四乙基罗达明标记抗体方法
（三）藻红蛋白标记抗体方法
四、荧光抗体的质量控制
主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。
1.特异性染色效价测定
2.非特异性染色测定
3.吸收试验
4.F/P比值的测定方法
五、免疫荧光组织化学染色方法
1.直接法 简便、快速，用已知特异性标记荧光的一抗与组织细胞内抗原结合。
操作流程：(1)冰冻切片经固定，凉干PBS洗；石蜡切片脱蜡至水，消化30min，PBS洗。
(2)适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上，湿盒内37℃温育1h，PBS洗3×3min。
(3)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min，PBS洗3×3min，蒸馏水洗2次，除去Nacl结晶。
(4)pH9.0缓冲甘油封片。
(5)镜检
2.间接法 是直接的重要改进，先用标记的已知特异性一抗与组织细胞内抗原结合，随后用间接荧光标记二抗与一抗特异性结合。
操作流程
(1)冰冻切片经固定，凉干后PBS洗；石蜡切片脱蜡至水，PBS洗，酶消化，PBS洗3×3min。
(2)适当稀释特异性一抗，37℃孵育1h，或室温4h，或4℃过夜，PBS洗3×3min。
(3)荧光标记二抗适当稀释37℃ 30min，PBS洗3×3min。
(4)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min，PBS洗3×3min。
(5)封片，镜检。
六、荧光显微镜检查方法
1.荧光显微镜 荧光显微镜是免疫荧光组织化学的基本工具。它是由超高压光源，滤片系统(包括激发和压制滤板)，光学系统和摄影系统等主要部件组成，是利用一定波长的光激发标本发射荧光。
(1)光源 光源的亮度应根据荧光素的类型选择。小功率汞灯可满足激励一般荧光染料的要求。对于免疫荧光染色需用大功率超高压汞灯。其工作时，两个电极间放电，引起球内水银蒸发，经过5～15min，球内气压升至50～70标准大气压，此时达到最高亮度，成为稳定工作状态。
(2)滤片系统 是荧光显微镜的重要组成部分，是获得特定波长光，清晰的荧光影像和发挥显微镜最佳性能之关键。了解滤片性能，正确地选择滤片是观察荧光效应的前提和必要条件。
滤片系统包括激发滤片，阻断滤片、隔热滤片，分光镜和其他一些中性滤片。
荧光显微镜的滤片系统
2.标本制作要求
(1)载玻片厚度应在0.6～1.2mm之间
(2)盖玻片应光洁，厚度在0.17mm左右
(3)标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不能充分激分。
(4)封片剂 常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。甘油和0.5mol/L pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液等量混合作封片剂。
荧光信号增强封片剂
mowiol 40-88 4.8g
甘油 12ml
蒸馏水 12ml
0.2mol/L Tris(pH8.5) 24ml
上述混合（加热溶解），5000g离心，15min，最后加入1.4-diazobicydo-[2,2,2]-octane(DABcos)，终浓度2.5%(约1.25g)，溶解后，分装存于-20℃中。
(5)镜油
3.使用荧光显微镜注意事项
(1)严格按说明书操作，不要随意改变程序。
(2)应在暗室中进行检查。
(3)防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源时应戴上防护眼镜。
(4)检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯强度逐渐下降，荧光减弱。
(5)荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。光源关闭后必须在30min后才能再启动光源，一天中应避免数次点燃光源。
(6)标本染色后应立即观察。
(7)荧光高度的判断标准，分四级“ －”为阴性，“ ＋”为仅能见明确可见的荧光；“ ＋＋”为可见有明亮的荧光；“ ＋＋＋”为可见耀眼的荧光。
七、非特异性染色的消除方法
根据产生的原因采取适当的方法，常用方法：
1.动物脏器粉末吸收法
2.透析法
3.Sephadex G-50柱层析法
4.DEAE纤维素柱层析法
5.荧光抗体稀释法
6.纯化抗原方法
7.纯化抗体方法
8.伊文氏蓝衬染方法：0.01%伊文氏蓝
八、激光扫描共聚焦显微镜
激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)是80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品。
实现了对细胞内部非侵入式光学断层扫描成像，从而对被检物体样品从停留到表面单层，静态平面的观察进行到立体，断层扫描、动态全面的观察，在生命科学研究中得到迅速应用。
1.仪器构成
(1)计算机系统：控制着机械，光学、声学系统及各种外围设备。
(2)激光照射系统：氩离子激光器和声光调节器。
3.光信号接收和成像方式
(1)光信号接收 生物样品发出的荧光通常有二种接收方式：①由光电倍增管（PMT）把光信号转变成电信号；②利用电荷耦合器（CCD）把光信号转变成电信号。
(2)成像方式 ①载物台运动成像：以直径很小的激光束照射样品，照射点发出的荧光信号经PMT变成电信号，然后载物台移动到下一点，记录该点的荧光强度。该方法无轴向像差，成像时间长；
②反射扫描成像方式，通过转动反射镜使激光连续照射样品，由CCD摄像机记录下照射点所发射的荧光，成像速度快。
4.参数的选择
基本参数：Confocal,pinhole,detector,
PMT,Stepsize, X points, Y Points, scanstr,speed,LaserPwr,Auto zoom, Display, BR subval,Samples/pt等
5.性能特点：分辨率高，灵敏度高，扫描速度快，扫描范围大，图像存取方便，可进行光切片的观察，可进行定量荧光分析。
6.应用
(1)组织光学切片 可对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的系列“ 光学切片”，得到其各层面的信息-“ 显微CT”。
(2)三维图像重建
(3)细胞物理和生物化学测定
(4)荧光的定量、定位分析
(5)Ca2+、pH及其他细胞内离子的实时定
量测定
(6)粘附细胞的分选
(7)激光细胞显微外科及光陷阱技术
(8)荧光光漂白恢复（FRAP）技术
(9)胞间通讯的研究
(10)细胞膜流动性测定
(11)光活化技术
一、荧光的特征
分子都含有电子，电子在不停地运动着。根据量子理论，运动着的电子可以处于一系列不连续的能量状态中，电子遵守一定的规则，要以从一个能级向另一能级跃迁，并伴随着与能级差相对应的特定能量的吸收或释放。
激发 当电子吸收能量跃迁到较高能级，
这个过程叫激发。
发射 以辐身方式跃迁时，能量转化成相
应波长的光，这个过程叫发射。
荧光 跃迁到激发态的电子，大多处于单重激发态。如果电子直接从单重激发态以辐身方式跃迁到基态，由于单重激发态很不稳定，半衰期很短，发射持续的时间也很短，这种发射光，叫荧光。
二、荧光素
能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光色素，必须具备：吸收激发光的光能并发射荧光。
1、具备用于标记抗体的荧光素条件
(1)应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基团，结合后不易离解，而未结合的色素及其降解产物易排除。
(2)荧光效率高，与蛋白质结合后荧光
素质量下降不多。
(3)标记后对抗体的免疫学性质和生化
性质无影响。
(4)结合方法简便而快速，并且较稳定。
2.荧光素的种类
(1)异硫氰酸荧光黄（FITC）：分子量390D，最大吸收光谱为490～495nm，最大发射光谱为520～530nm。呈现明亮的黄绿色荧光，分子量389.4。
(2)四甲基异硫氰酸罗达明（TRITC）是罗达明的衍生物，易溶于水，最大吸收光谱为550nm，最大发射光谱为620nm，呈橙红色荧光。
(3)四乙基罗达明(RB200) 呈褐红色粉末状，溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光谱570nm，最大发射光谱596～600nm，呈明亮橙红色荧光，分子量580，RB200不能直接和蛋白质结合，要先经五氯化磷反应，转化成硫酰氯，再与蛋白质的氨基结合。
(4)1-二甲基氨基-5-硫酰氯
(5)4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪（SITS）
(6)得克萨斯红（Texas red）
(7)藻红蛋白（PE）
(8)花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5）
三、荧光素标记抗体的方法
(一)FITC标记抗体的方法
1.Marsshall法
(1)原理：当FITC在碱性溶液中与抗体反应时，主要是抗体分子上的赖氨酸å -氨基与FITC上硫碳胺键结合，一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个。
(2)操作流程
抗体与荧光素比例为50-100:1
抗体的准备：20mg/ml，碳酸盐缓冲液为总
量的1/10。
荧光素的准备：用分析天平准确称取
0.01mgFITC/1mg抗体。
结合：边搅拌边将称取的荧光素加入抗体
溶液中。
透析
过柱 Sephade×G50或 G25
保存 4℃ -40℃等量甘油分装保存。
2.Chadwick法
3.改良法
4.透析标记法
（二）四乙基罗达明标记抗体方法
（三）藻红蛋白标记抗体方法
四、荧光抗体的质量控制
主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。
1.特异性染色效价测定
2.非特异性染色测定
3.吸收试验
4.F/P比值的测定方法
五、免疫荧光组织化学染色方法
1.直接法 简便、快速，用已知特异性标记荧光的一抗与组织细胞内抗原结合。
操作流程：(1)冰冻切片经固定，凉干PBS洗；石蜡切片脱蜡至水，消化30min，PBS洗。
(2)适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上，湿盒内37℃温育1h，PBS洗3×3min。
(3)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min，PBS洗3×3min，蒸馏水洗2次，除去Nacl结晶。
(4)pH9.0缓冲甘油封片。
(5)镜检
2.间接法 是直接的重要改进，先用标记的已知特异性一抗与组织细胞内抗原结合，随后用间接荧光标记二抗与一抗特异性结合。
操作流程
(1)冰冻切片经固定，凉干后PBS洗；石蜡切片脱蜡至水，PBS洗，酶消化，PBS洗3×3min。
(2)适当稀释特异性一抗，37℃孵育1h，或室温4h，或4℃过夜，PBS洗3×3min。
(3)荧光标记二抗适当稀释37℃ 30min，PBS洗3×3min。
(4)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min，PBS洗3×3min。
(5)封片，镜检。
六、荧光显微镜检查方法
1.荧光显微镜 荧光显微镜是免疫荧光组织化学的基本工具。它是由超高压光源，滤片系统(包括激发和压制滤板)，光学系统和摄影系统等主要部件组成，是利用一定波长的光激发标本发射荧光。
(1)光源 光源的亮度应根据荧光素的类型选择。小功率汞灯可满足激励一般荧光染料的要求。对于免疫荧光染色需用大功率超高压汞灯。其工作时，两个电极间放电，引起球内水银蒸发，经过5～15min，球内气压升至50～70标准大气压，此时达到最高亮度，成为稳定工作状态。
(2)滤片系统 是荧光显微镜的重要组成部分，是获得特定波长光，清晰的荧光影像和发挥显微镜最佳性能之关键。了解滤片性能，正确地选择滤片是观察荧光效应的前提和必要条件。
滤片系统包括激发滤片，阻断滤片、隔热滤片，分光镜和其他一些中性滤片。
荧光显微镜的滤片系统
2.标本制作要求
(1)载玻片厚度应在0.6～1.2mm之间
(2)盖玻片应光洁，厚度在0.17mm左右
(3)标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不能充分激分。
(4)封片剂 常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。甘油和0.5mol/L pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液等量混合作封片剂。
荧光信号增强封片剂
mowiol 40-88 4.8g
甘油 12ml
蒸馏水 12ml
0.2mol/L Tris(pH8.5) 24ml
上述混合（加热溶解），5000g离心，15min，最后加入1.4-diazobicydo-[2,2,2]-octane(DABcos)，终浓度2.5%(约1.25g)，溶解后，分装存于-20℃中。
(5)镜油
3.使用荧光显微镜注意事项
(1)严格按说明书操作，不要随意改变程序。
(2)应在暗室中进行检查。
(3)防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源时应戴上防护眼镜。
(4)检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯强度逐渐下降，荧光减弱。
(5)荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。光源关闭后必须在30min后才能再启动光源，一天中应避免数次点燃光源。
(6)标本染色后应立即观察。
(7)荧光高度的判断标准，分四级“ －”为阴性，“ ＋”为仅能见明确可见的荧光；“ ＋＋”为可见有明亮的荧光；“ ＋＋＋”为可见耀眼的荧光。
七、非特异性染色的消除方法
根据产生的原因采取适当的方法，常用方法：
1.动物脏器粉末吸收法
2.透析法
3.Sephadex G-50柱层析法
4.DEAE纤维素柱层析法
5.荧光抗体稀释法
6.纯化抗原方法
7.纯化抗体方法
8.伊文氏蓝衬染方法：0.01%伊文氏蓝
八、激光扫描共聚焦显微镜
激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)是80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品。
实现了对细胞内部非侵入式光学断层扫描成像，从而对被检物体样品从停留到表面单层，静态平面的观察进行到立体，断层扫描、动态全面的观察，在生命科学研究中得到迅速应用。
1.仪器构成
(1)计算机系统：控制着机械，光学、声学系统及各种外围设备。
(2)激光照射系统：氩离子激光器和声光调节器。
3.光信号接收和成像方式
(1)光信号接收 生物样品发出的荧光通常有二种接收方式：①由光电倍增管（PMT）把光信号转变成电信号；②利用电荷耦合器（CCD）把光信号转变成电信号。
(2)成像方式 ①载物台运动成像：以直径很小的激光束照射样品，照射点发出的荧光信号经PMT变成电信号，然后载物台移动到下一点，记录该点的荧光强度。该方法无轴向像差，成像时间长；
②反射扫描成像方式，通过转动反射镜使激光连续照射样品，由CCD摄像机记录下照射点所发射的荧光，成像速度快。
4.参数的选择
基本参数：Confocal,pinhole,detector,
PMT,Stepsize, X points, Y Points, scanstr,speed,LaserPwr,Auto zoom, Display, BR subval,Samples/pt等
5.性能特点：分辨率高，灵敏度高，扫描速度快，扫描范围大，图像存取方便，可进行光切片的观察，可进行定量荧光分析。
6.应用
(1)组织光学切片 可对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的系列“ 光学切片”，得到其各层面的信息-“ 显微CT”。
(2)三维图像重建
(3)细胞物理和生物化学测定
(4)荧光的定量、定位分析
(5)Ca2+、pH及其他细胞内离子的实时定
量测定
(6)粘附细胞的分选
(7)激光细胞显微外科及光陷阱技术
(8)荧光光漂白恢复（FRAP）技术
(9)胞间通讯的研究
(10)细胞膜流动性测定
(11)光活化技术
