（共享）免疫学实验室方法
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本章讨论临床免疫学实验室用于检测分析物的分析方法，这些分析物在诊断或监测有立即发生的超敏反应或免疫性疾病的病人很有用。通常把这些实验方法总称为免疫化学技术或免疫测定方法，因为它们使用了抗体，抗原，或这两者作为检测试剂。
至于天然抗体，估计一个个体能合成106-108那么多，每一种抗体都有不同的结合特异性。1.2 与抗原相互作用的结合已特异性地把宿主的防御定为目标，在该防御中，抗体起着许多效应分子的功能（如结合补体，皮肤致敏活动）。
抗体作为实验试剂已有很多年了。可以发展专门针对想要抗原的特殊抗体。另外，抗体试剂与抗原相互作用的结合通常具高亲和力，这就使得检测很少量靶抗原成为可能。典型的靶蛋白是：高度纯化的蛋白质、糖蛋白、或这些分子复杂异质的混合物（如豚草属花粉）。
由于抗原结合区与效应分子的功能决定区在不同的区域，所以，免疫球蛋白（Igs）在基因和分子水平实际上是组合结构。例如，把编码某一特定恒定区的基因和许多编码可变区的基因中的任何一个相连，这一特定恒定区介导补体结合的能力能够得以维持同时仍能被精确地定为靶目标。因此，无论是由恒定区基因决定的防御机制，还是由许多可变区基因决定的结合抗原的特异性，Ig的基因家族都成功地保持了恒定。其中，可变区基因在进化期间已增加了很多，同时通过基因复制和体细胞突变，也扩充了许多。3.4
同类抗体（异构型），Ig分子的恒定区中含有共同的肽结构。虽然这些抗体可以与不同的抗原起反应，但在免疫测定中，可以用同一抗体试剂检测他们。例如，与两种不同变应原（如豚草属花粉和猫的毛皮垢屑）起反应的IgE抗体，它们两者都可以用抗-IgE抗体来检测。其中，该抗-IgE抗体能与所有IgE分恒定区的某一肽段特异性地结合（见后）。在这个例子中，虽然每种抗体都有不同的抗原结合位点，但它们的ε重链
恒定区的某一肽段都能与抗-IgE抗体反应。
当设计一个用抗原或抗体作试剂的免疫测定方法时，在选择合适的分析方法方面，最重要的因素是待测物（抗原或抗体）的浓度。临床免疫实验室最常用的免疫化学方法有：（1）凝胶沉淀法和比浊法，用于浓度相对比较高的分析物（毫克到微克每毫升）（2）竞争性替代或免疫测定技术，如放射性免疫测定（RIA）和酶免疫测定（EIA），用于较低浓度的分析物（微克到纳克每毫升）。免疫荧光显微技术，包括流式细胞仪，对检测细胞表面抗原或完整细胞内某些细胞浆或细胞核抗原很有用。各种方法大致的灵敏度限度列在表31-1。如接下来这部分所描述的那样，各种方法最终都是以检测抗原抗体之间的反应为根据
抗原与抗体的结合作用
抗体（Ab）和抗原(Ag)的交互作用与经典的质量动力反应学描述的双分子反应相似：
[Ag]+[Ab]
游离抗原和游离抗体可逆地反应形成抗原-抗体复合物。重排等式可以得到一个亲和力（平衡或结合）常数K：
k=
亲和力常数描述了结合抗原与游离抗原之间的关系，亲和力常数的值越高，表明平衡中有更多的抗原可以与抗体结合形成复合物。亲和力常数可由实验得到。例如，用平衡透析实验可以测出抗溴脱氧尿核苷（BrdU）单克隆抗体的亲和力常数。5
在含定量抗- BrdU抗体的溶液中透析不同浓度的放射性标记的BrdU。由于BrdU可以自由平衡地穿过透析膜，膜两边BrdU的浓度应该是相等的。含抗体一侧的放射性活度有任何的增加都是因为抗体结合了标记的BrdU。通过测定透析膜两边的放射性活度，就可以计算出结合抗原的浓度。这些数据的图解描述在图31-1，A中。含抗- BrdU抗体那一侧中的抗原浓度增加。当反应达到饱和时，结合抗原与抗体的比率达到2，这就是抗体的效价。另外，从第一个等式中可以看到，当一半的结合位点被占据时，[AgAb]=[Ab]和K=1/[Ag]。因此，本例中，在最大结合位点的一半（图31-1，A，y轴=1），由图解可得到K=1X107L/mol。
这个图是非线性的，很难直接从中确定最大结合一半的点。然而，像图31-1，B所示，重新处理数据，可以得到一个线性的表述。这种图解叫Scatchard 图。这条直线斜率的倒数就是亲和力常数的值。X-截距结合交互作用的效价。任何允许检测结合和游离抗原的实验系统，如平衡透析，都可以用来检测亲和力常数。
亲和力常数的知识对预测某一特殊抗体能否用来检测某一特定范围浓度的抗原很有用。例如，在前面描述的亲和力常数为107L/mol的抗- BrdU抗体的例子中，当BrdU抗原的浓度在10-7mol/L或30ng/ml范围时，抗体结合位点的一半被占据。
上述讨论是有关单克隆抗体的，还举了一个真正的双分子交互作用，在这个反应中，Scatchard 分析可以准确地估计亲和力常数。然而，多克隆抗血清与抗原的交互作用很显然不是真正的双分子反应。当免疫系统中出现抗原时，很多位点都被看成具有抗原性。因此，在结合位点方面，很多抗原都被认为是多效价的，而且能与多种不同抗体反应。另外，在任何一个单独的抗原性位点上，许多不同抗体都可以与之反应，且各抗体的反应都有轻微的不同，那么各抗体就都有不同的亲和力。由于多位点结合反应每一个都有不同的亲和力，抗血清与复杂抗原的Scatchard图表通常都不是线性的。在低抗原浓度时，高亲和力抗体决定直线的斜率，而在高抗原浓度时，由更丰富的低亲和力抗体支配曲线。这种情况，可以用直接结合图表来确定平均亲和力常数，把它作为抗体一半饱和时相应的抗原浓度（看图31-1，A）。
多价抗原与多克隆抗血清的结合作用不能用同样的方法用数学的方法定义亲和力常数，而是用相对不那么精确的术语亲和力来描述它们之间的相互作用。亲和力受抗原的效价及抗血清中每一种抗体的影响。多效价的结合作用很复杂，因为与一个位点的结合通常都会影响到同一分子中与别的抗原性位点的结合。多效价通常产生积极的合作效应，即一个位点的结合会促进与第二个位点的结合，最终的亲合力比各抗原-抗体相互作用的亲和力的总和要大。人们体会到这种合作效应是因为他们注意到多克隆抗体的亲和力一般小于108L/mol，而单克隆抗血清的亲和力超过1011L/mol。
免疫测定中抗原抗体作为反应物的定量
通过使用免疫方法测定抗原和抗体间的结合，可以检测出溶液中抗原和抗体的浓度。临床实验室最常用的免疫测定技术可以分为两类。第一类是敏感度相对来说不那么高的技术，它包括以光散射和凝胶沉淀为原理的方法，这些方法中，抗体和抗原结合后发生生物物理学变化，然后产生信号（如形成沉淀）。第二类技术包括RIA、EIA、荧光免疫测定和化学发光免疫测定，在检测抗体与抗原间的结合时，这些方法需要用放射性核素，酶，荧光或能发光的分子修饰抗原或抗体试剂。不论哪一种技术，为定量检测浓度而转换结合信号时都要求使用标准曲线，该标准曲线中，加的是已知量的反应物。
使用光散射来检测单克隆抗体与可溶性抗原的结合就说明了这个原理。6抗原和抗体在溶液中相互作用后形成分子复合物，该复合物比两种反应物的分子量都要大。光散射强度与分子量的平方成比例，7可以把抗原抗体复合物的形成描述为有更多的光散射，而不是由各蛋白质产生的光散射的总和。例如，将含单克隆抗体的溶液放置于比浊计中，然后加入递增量的抗原。抗原-抗体复合物产生光散射的增量比抗原抗体单独产生的光散射要大（图31-2）。光散射图的转折点出现在抗原与抗体的克分子浓度比等于2的地方。在这一点，抗体与抗原的反应达到饱和，因为每个IgG抗体分子都有两个结合位点。低于饱和点的任何一处，都有一个唯一的光散射信号与抗原浓度相对应。用已知浓度的抗原溶液可以得到光散射信号的强度，进而得出标准曲线。如果检测一个未知的标本，产生一个光散射信号y，那么从标准曲线就可定义出抗原的浓度等于x（看图31-2）。所有的定量免疫测定都遵循下列原则。那就是（1）抗原-抗体复合物的量与被结合的抗原量成比例，（2）信号（如光散射）与抗原抗体复合物的量成比例，（3）用已知浓度的抗原标准化信号，（4）用标准曲线把信号转换成浓度检测。
实践中，本例描述的散射光信号很小以致于它仅用于检测纯化的单克隆抗体和纯化的抗原之间的结合作用。血清中别的蛋白质的散射光背景会掩盖抗原-抗体复合物的散射光。抗体与抗原结合后会出现内在的变化，因此，大多数以此为原理的免疫测定方法都会使用多克隆抗血清，并以抗原-抗体的沉淀反应为原理。因为大多数抗原都有好几个可以被抗体识别和结合的位点，大多数抗血清也含有好几种可以识别同一抗原分子不同结构的抗体。因此，在典型的抗原-抗体反应中，一个单独的抗原可以有很多的抗体结合到它的表面。由于每种抗体分子都有两个结合位点，那么与第一个抗原结合的抗体都可以再与另一个相同的抗原结合，而每个抗原分子又可能有许多的抗体与之结合。这种交叉结合（或交叉连接）的现象导致了大量的不可溶的抗原抗体复合物的形成，该复合物叫晶格（图31-3，A）。晶格的形成是由于抗体双价的结合结构以及抗原多结合位点的出现。抗原过量时，抗体被饱和，没有足够的抗体与复合物交叉连接（图31-3，B）。抗体过量时，抗原被抗体饱和，没有足够的抗原与复合物交叉连接（图31-3，C）。使用单克隆抗体而不是多单克隆抗血清时，每个抗原只能与一个单独的位点结合，不会有交叉连接（或晶格形成）出现（图31-3，D）。
沉淀反应是最早被描述的抗原抗体反应之一。8.9可以在某种介质如琼脂里进行反应，琼脂允许蛋白质分子扩散或电泳但大的，不溶性的抗原-抗体复合物却不行。以琼脂为基础，最常用的定量免疫化学技术是放射免疫扩散（RID）。10 RID是最简单可靠的免疫测定技术之一，但它也有有一些缺点。沉淀反应发展缓慢，有时需要好几天才能得出结果。单独一个测定，能被分析的未知的东西很有限，且此技术相对来说灵敏度不是很高。进行RID时，先在玻璃板上铺一薄层琼脂，整个琼脂内均匀地含有溶解的抗体试剂。在琼脂中央打一小孔，孔里放置（标准或未知的）抗原，接着抗原在琼脂内扩散，形成一个浓度梯度。抗原在琼脂内移动时，被抗体结合，但在孔附近的抗原过量带，抗原-抗体复合物仍保持可溶。抗原和抗原-抗体复合物继续扩散，直到等价带中有足够的抗体被结合形成抗原-抗体复合物晶格。等价带中形成的沉淀在含抗原的孔周围形成环状。标本中抗原浓度越高，等价带中需要的抗体越多，沉淀环的直径越大。沉淀环的平方（即面积）与抗原的浓度成正比。
典型的RID测定是：把抗体加入到融化的琼脂中，然后把琼脂倒在一玻璃载玻片上，让它凝固。在凝胶中打孔，各孔中分别加入未知标本和一系列已知浓度的抗原标准物。将载玻片置于湿的温箱中孵育30分钟到2小时，然后就可以测定沉淀环的直径（图31-4）。RID不需要特殊仪器，临床上许多小的实验室都使用该技术。
也可用比浊法来对沉淀反应进行定量。比浊法比凝胶技术更敏感、更快速，且能自动化。如前边所提到的，比浊法检测的是被散射的光，散射光的强度与溶液形成的抗原-抗体复合物的分子量的平方成比例。在终点（平衡）比浊法中，抗原和抗体孵育30分钟到2小时，测定散射光，将它和标准曲线对比，该标准曲线上的散射光与抗原浓度相对应。在速率比浊法中，抗原与抗体混合后，在很短的一段时间内，立即检测多个散射光，通过这样，可以测定出抗原-抗体复合物形成的起始速率。散射光形成的速率越快，表明抗原抗体复合物形成的速率越快和抗原的浓度越高。比浊免疫分析法快速、可靠、容易实现自动化。利用商业提供的设备和抗体试剂，许多蛋白质都可以在临床实验室常规检测。自动化的比浊法也可用于血清Igs(包括IgE),白蛋白,C3,C4, 转铁蛋白, α1抗胰蛋白酶,C反应蛋白,C1 酯酶抑制因子的定量检测;尿液中肌球蛋白和白蛋白水平的测定;以及脊柱液中IgG和白蛋白水平的检测。
第二类免疫测定需要用一种“通讯群体”对反应物（抗原或抗体）中的一个进行修饰。放射性核素，酶，荧光染料或发光的分子都可用做出现了抗体结合抗原的信号。这些方法在技术上实施起来更困难，但它们都是必要的，因为生物标本中微量（ng/ml）抗原或抗体的检测和定量都要求更高的灵敏度。最先描述RIA的原理是1960年胰岛素的测定，而且这门技术是灵敏度最高的技术之一。11 典型的竞争性替代RIA中：先放射性标记抗原，然后将标记抗原与抗体一起孵育，再把与抗体结合的标记抗原与未结合的抗原分离，最后检测已结合的放射性活度。如果在加入标记抗原的同时也加未标记的抗原，未标记抗原就会竞争有限的抗体结合位点，与被提供的抗体结合的标记抗原就变少。试管里含固定量的标记抗原和抗体，如果往里加入递增浓度的未标记抗原，就可构建一条标准曲线。这种方法叫竞争替代法因为抗体试剂的量不足以结合所有标记和未标记的抗原分子。做这个实验时，临床医生一定要有特异性的抗血清或单克隆抗体，纯化的放射性标记的抗原，纯化的未标记的抗原标准物，以及分离结合跟游离抗原的方法。多数RIAs都是用125I放射活性通讯群体，用γ闪烁记数仪检测发出的放射性活度。由于具有敏锐的分析灵敏度，RIAs的用处很大，但由于放射性核素的使用，它们的放置时间又很短。最常见的分离技术是使用第二抗体，该抗体能跟第一抗体反应形成沉淀。已结合的放射性标记的抗原跟复合物一起沉淀下来，通过离心分离结合和游离的放射性活度。最近，已设计出一些使用固相结合抗体的方法（图31-5，A）。这些方法中，抗体结合于固相表面，如试管内壁或聚苯乙烯珠粒。往试管里加入标准或未知抗原以及放射性标记抗原后，通过简单地倾倒试管或移走珠粒就可分离结合和游离抗原。
固相结合抗体的使用引致了“三文治”免疫测定的发展，也叫两位点免疫测定方法（IMAs）。在这一类型的方法中，临床医生纯化和放射性标记第二抗体而不是标记纯化的抗原。第一抗体与固相结合，然后加入抗原，最后通过加入放射性标记的第二抗体，该抗体也能与抗原结合，就可以检测与固相结合的抗原。随着更高浓度的的抗原标准物的加入，更多的标记抗体与固相结合，从而形成一条标准曲线（图31-5，B）。免疫放射测定（IRMA）技术的优点是标记的是纯化的抗体而不是纯化的抗原。抗体是稳定的蛋白质分子，容易被放射性核素、酶和能发光的分子标记上。但有些抗原在化学标记过程中却有可能被改变或遭到破坏。
如前所述，两位点IMA的基本原理是可以使用多种通讯群体。也就是说，除了使用放射性核素标记的第二抗体，第二抗体还可与酶或发光分子结合，然后用分光光度计或发光计而不是用γ闪烁记数仪来定量检测结合抗体。如果用的是酶标记，该方法叫EIA。典型的EIA是通过加入底物溶液来定量检测已结合的酶连第二抗体，该底物被酶水解后颜色发生改变。因此，加入到试管里的抗原越多，被结合的酶连二抗也越多，同时，在给定的时间内，颜色强度的变化也越大。许多EIAs都用微量滴定板进行，然后用自动分光光度计定量，该分光光度计能直接读取多孔板的吸光度。EIAs有好几个优点：不使用同位素，试剂有较长的放置时间，没有废物处置问题。三文治EIA方法的分析灵敏度与竞争性替代RIA相近。
检测IgE蛋白和抗原特异性IgE抗体的免疫化学方法
临床上评价过敏性疾病时，就已确定了IgE蛋白质（IgE）和抗原特异性IgE抗体（IgE抗体）的实验室值。多种分析方法用于检测体液中的IgE和IgE抗体。
IgE蛋白：分析方法和正常值
下列方法均可用于血清中IgE的测量：（1）琼脂免疫扩散，（2）琼脂糖RIA，用放射性标记的第二阶段的抗血清检测沉淀，（3）竞争性替代RIA，（4）两位点IRMA和两位点EIA，12-15（5）动力比浊法。免疫扩散技术还没有足够的灵敏度检测正常血清或分泌物的IgE，所以这些方法还不适于临床应用。
RIA，两位点EIA和动力比浊法可以检测血清中浓度低至0.5U/ml(1.2ng/ml)的IgE，以方便的两位点免疫测定技术为原理的试剂盒在商业上已有提供。检测IgE的IMA遵循下列原则：与固相共价结合的多克隆或单克隆抗-IgE抗体与血清或标准液一起孵育，在固相孵育期间检测结合的抗体，该固相上带有放射性标记的，经亲和力层析纯化了的单克隆抗体，或带有与酶连接的抗-IgE抗体。与标准曲线对比，可以计算出血清IgE的浓度。对临床实验室常规使用的方法来说，IgE检测的最大灵敏度是7.5-50 U/ml（18-120 ng/ml）。更低浓度的IgE可以用IMA法检测，但与检测更高浓度相比，IMA在检测0.5-4 U/ml这个浓度范围时，它的可靠性已大大减少。临床上已有大量的研究是关于正常（非过敏性）个体血清中IgE浓度。不同的检测技术在成人和儿童身上产生的结果有轻微的不同。12-15 尽管有差异，但在IgE水平随年龄的发展方面，以及不考虑检测技术，在健康成人身上观察到的IgE浓度的频率分布方面，都存有一致的趋势。健康成人IgE浓度的频率分布明显地不对称，它的95百分位限度很宽，还有一个不成比例的大量的低IgE值。因此，在计算正常的95百分位限时，很多观察者都用对数转换来处理他们的数据，通过这样得到正常值上限，这些上限与几何平均值（表31-2）相比，表面上看起来非常高。当用正常值的上限（一般是平均值+ 2标准差）来鉴定过敏性个体时，这些高的正常值上限降低了血清IgE实验作为临床变态反应筛选实验的诊断灵敏度。
儿童IgE的血清浓度随着儿童的成长而缓慢地增加，大约5-7岁的时候达到成人水平。15.16同龄男孩和女孩的IgE水平是相同的。与低于40岁的成人相比，年龄超过70岁的个体，IgE水平有下降的趋势。17
作为过敏性疾病诊断试验的血清IgE水平，在评述它的有效性时，单独讨论它在儿童和成人身上的使用是正确的。出生或婴儿期间，血清IgE水平增高，通常较早就会有临床变态反应发生。18 Kjellman18 发现，在年龄的95百分位限度以上，在双亲都有过敏性疾病家族史的孩子中，75%的孩子血清IgE水平都增高。在一给定年龄且IgE水平比平均值高出一个标准差的健康孩子，与具有较低IgE水平的群体相比，前者在随后的18个月期间发生过敏性疾病的事件要比后者多十倍。
婴儿过敏性疾病的诊断很复杂，因为这个年龄的群体，鼻漏是过敏反应最常见最开始的表现，但婴儿期间，上呼吸道感染也很常见，有可能无法在临床上将它与鼻炎区分开来。 对婴儿，IgE的测定很有价值，因为当假定的临床诊断完全不同时，它可以提示医生有可能是过敏性疾病。这种情况下，血清IgE水平超过20 U/ml支持过敏性疾病的诊断，19 但在婴儿期间或以后的生活里，血清IgE水平正常，并不能排除过敏性疾病的诊断；事实上，在排除过敏性疾病的诊断时，应该把别的试验诊断结果，如皮肤测试和IgE抗体检测都考虑进来。有时候，过敏性疾病的出现信号很清楚（如具有先天性过敏症家族史的婴儿出现湿疹和鼻炎），对于临床上这种情况，几乎不用血清IgE水平来提供额外的信息。
对大一点的儿童，情况相似。当把正常范围的上限做为诊断临界值时，血清IgE蛋白质的测量已经限制了过敏性疾病的诊断灵敏度。一般，对好几种变应原具高敏性以及带有多种过敏性疾病的孩子，有增高的血清IgE水平；而那些只对少数变应原过敏以及只有少数内脏被涉及的孩子，血清IgE水平通常都正常。临床上，有些孩子对大量变应原都过敏，在他们身上，诊断灵敏度最大。20
具有先天性过敏症的孩子，皮肤表现的疾病出现和胃肠道症状的出现，表明血清IgE水平增高的可能性很大。也有证据表明，对花粉变应原过敏的孩子，血清IgE水平增高的频率，比对尘螨和霉菌变应原过敏的孩子要大；过敏性疾病牵涉到多个靶器官的孩子，血清IgE水平的增加，也比疾病更有限的孩子要高；极度增高通常在带有皮肤表现的病人身上出现。对过敏性疾病，IgE水平增高的诊断特异性非常好。事实上，两者间的联系很紧密，以致于有时候那些无症状但IgE水平增高的孩子被称为预过敏的，这反映了他们会发展到临床变态反应体征的假定。
对于怀疑有过敏性疾病的成人，血清IgE蛋白质的检测在诊断用途上比较有限。成人呼吸系统变态反应的研究结果表明，大约50%的外源性哮喘病人和低于5%的所谓内源性（非特应性变态反应的）哮喘病人有血清IgE水平的增高。14对一种或少数几种变应原过敏的哮喘病人通常血清IgE水平正常。对成人，最高的IgE水平通常出现在对好几种变应原都过敏，而且合并哮喘，皮肤炎和鼻炎人身上。与儿童的情况一样，当过敏性疾病的诊断不是很明确的时候，血清IgE水平有限的诊断敏感性限制了IgE测量在这种情况下的临床用途。但并不是说，这种情况就不需要测定血清IgE，因为血清IgE水平增高表明发生过敏性疾病的可能性更大。
血清IgE水平的显著升高还与过敏性支气管肺麴菌病有关。21该病通常在外源性哮喘病人身上出现，持续时间长。急性肺部浸润期间，每一个过敏性麴菌病病人的早期，都会出现血清IgE水平的增高，但在疾病的发展过程中，血清IgE水平可能会出现比较大的波动。在活动性肺疾病的病人身上发现血清IgE水平正常，实际上可以排除该诊断。
抗原特异性IgE抗体：分析方法和结果报告
有两种方法用来检测抗原特异性IgE抗体：（1）IgE抗体检测，前面称为放射免疫吸附试验（2）淋巴细胞组胺释放试验。首次描述淋巴细胞组胺释放试验是在50多年以前，随后它被改进和自动化。22-25先用葡聚糖沉淀法分离外周血淋巴细胞，洗涤，用含钙和镁离子的缓冲液悬浮。往洗涤过的固定量的淋巴细胞中，加入不同浓度的变应原提取物，混合物在37℃孵育一小时。4℃冷却试管以终止反应，通过离心分离细胞。变应原与结合在细胞上的IgE抗体发生反应后，嗜碱细胞释放组胺至上清液，先用丁烷再用酸提取组胺。可用荧光分光光度计或RIA方法检测提取物中的组胺浓度。26.27手工操作的荧光分光光度计法，可检测大约1ng的组胺。RIA法更敏感。用细胞释放的组胺占组胺总浓度的百分比来表示结果，将未接触过变应原提取物的淋巴细胞溶于高氯酸，然后在该细胞溶解产物中检测组胺的总浓度。
淋巴细胞组胺释放试验详细说明了结合在细胞上的IgE抗体的特异性，也表明了释放介导因子的机制在功能上的完整。大约15%的个体，他们的淋巴细胞在体内不释放组胺。28尽管已发展了自动化系统来检测组胺，但组胺释放试验的临床应用仍然有限，因为它要求使用新鲜血液，而且，仅单独使用血液的一部份就能检测出的变应原也很有限。29还有，用这些方法测定组胺时，存在相当大的室内实验室差异。30
IgE抗体检测是一个双位点IMA。31该方法的第一阶段：IgE抗体待测的血清标本与固相结合的变应原免疫吸附剂反应。第二阶段：2-4小时后，冲掉没有抗体的血清部份，变应原与放射性标记或酶标，及经亲和力层析法纯化的抗体或单克隆抗-IgE抗体一起孵育。第二阶段的抗-IgE抗体与变应原免疫吸附剂的结合，可以检测在第一阶段被结合的抗体。
IgE抗体检测并没有测出IgE抗体的实际浓度。许多过敏性个体的血清，含的抗体浓度都超过变应原免疫吸附剂的结合能力，因而第一阶段孵育的上清液中，含有过剩的IgE抗体。32而且，由于大多数变应原都是复杂的蛋白质或糖化蛋白，所以，各血清包含的是能以不同的亲和力与变应原反应的抗体混合物。而且，在一限定的范围，第二阶段抗体的结合与血清里的IgE抗体浓度成比例。这层关系已在用校正的标准曲线定量测定IgE抗体的研究应用中被用到。33.34然而，由于常规的IgE抗体检测，IgE抗体通常都过量，第二阶段抗体的结合不仅反映了待测抗体的量，还反映了它的亲和力，因此，结果是半定量的（见后）。
正如前面Wide等人31描述的那样，IgE抗体检测使用了与交联匍聚糖珠粒共价结合的变应原。随后人们又使用了各种别的固相材料，34.35包括纤维素载体，微晶纤维素颗粒，琼脂糖珠子，滤纸，多聚乙烯小杯或微量滴定孔。这些固相材料大多都是带有游离氢氧根的多醣类，该氢氧根能与溴化氰反应形成稳定的咪多卡中间物。36后者与蛋白质变应原的氨基部份反应形成共价键。与多聚乙烯孔或小杯的结合是非共价吸附。临床实验用时，变应原免疫吸附应该含有原始变应原提取物的所有免疫源性成份，并且与复杂的变应原具相同比例。虽然监测蛋白质与固相发生化学结合，相对来说比较容易，但在不同的变应原系统，很少有这样一些数据提供，即能够表明所有的相关变应原都被结合上了。Alternaria变应原已被具体地研究过，吸附研究表明，所有相关的免疫源性成份都被结合到了固相免疫吸附剂上。用固相免疫吸附剂吸附10个Alternaria过敏病人的血清，该血清池的皮肤致敏活性将丧失。37确保所有相关变应原都与固相免疫吸附剂结合上的另一方法就是，用含变应原的溶液与化学活化的微粒子免疫吸附剂结合。38冲洗，悬浮吸附试剂，从对还在疑问当中的变应原过敏的几个个体中得到血清，然后用这些不同量的血清来检测，从而得到一系列剂量反应曲线。当所有的变应原都固相免疫吸附剂结合后，剂量反应曲线变平。这点之前制备的各免疫吸附剂搭配后产生最终的固相免疫吸附剂。
如前所述，商业上已提供了好几种类型的变应原免疫吸附剂（表31-3）。商业提供的最普遍的是使用纤维载体或免疫吸附盘，但小杯型的免疫吸附剂如微量滴定孔，也有提供。无论使用哪一型试剂，在技术上都很方便。因为在测定过程中，不需要离心。试剂一旦配置好，都很稳定。
IgE抗体检测的分析灵敏度部份是由第二阶段使用的标记的抗-IgE抗体决定。商业上放射性标记、亲和力层析纯化的抗-IgE抗体作为蛋白质的检测，效果很好，可以定量检测ng的IgE抗体。39为了循环使用放射性标记的抗-IgE抗体，商业制造商已发展了使用酶连抗体的免疫方法。这些方法的分析特征跟旧的RIA方法相似。放射性标记的单克隆抗体在商业上也有提供。
几乎所有的常见变应原（包括动物上皮细胞，食物，霉菌，尘，昆虫毒液，一些药物，以及牧草、野草和树木的花粉）都被提供用于IgE抗体的检测。大多数药物都低分子量的复合物，没有游离的氨基部份，不会与溴化氰活化的固相起反应。然而，有些低分子量的药物，如胰岛素，却能与之结合并制成令人满意的免疫吸附剂。至于盘尼西林，Penicilloyl可以与Polylysine或蛋白质载体结合，后者又可与活化的固相结合，以用于IgE抗体的检测。40还没提供有类似的试剂，用于检测这类IgE抗体的检测，即抗所谓的盘尼西林微量抗原性决定物，该物质可能与一些急性过敏反应有关。41
如更前面所谈到的，IgE抗体检测不是定量的免疫测定，结果的描述也很复杂，因为有好几种公式可以用来给结果记分和报告结果。大多数商业上提供的、以结果的得分情况为根据的方法，都是以与病人剂量反应曲线数据做对比为根据。两种方法最常用：把一系列阳性质控物的稀释液与变应原免疫吸附剂一起孵育，得到参考曲线；或用结合抗-IgE抗体的免疫吸附剂去捕获标准液中的IgE，该标准液中一已知量的IgE蛋白质。（如25U/ml）。无论哪一种情况，都要定义一个阈值，用来表示IgE与固相的非特异性结合（阴性）和gE与免疫吸附剂的变应原特异性结合（阳性）之间的临界值。定量表示结果可以用单位/毫升，半定量表示是从0级（阴性）- 6级（强阳性），或用比率来表示：待测血清的结合跟同一方法检测到的非过敏个体血清池的结合相比。理论上，最后这种方法比较合适，因为不可能假设每一个抗体-变应原系统都产生相同的剂量反应曲线。
除了随机误差，还有别的原因导致IgE抗体检测的结果有误。IgE蛋白质水平增高的血清和许多变应原免疫吸附剂一起检测的时候，由于非特异性结合的增加，血清会产生临界或弱阳性结果。IgE浓度低于1000 U/ml时不会出现这种现象，除非把阴性和阳性的分界点设在很低的水平。42由于IgG抗体对IgE抗体结合的抑制，可能出现假阴性结果。43IgG抗体的亲和力与IgE抗体相似，而且，在免疫治疗中的病人身上，通常以ng/ml的浓度出现。44IgE抗体的检测，对判定已接受治疗的病人身上是否还有临床过敏性存在作用不大，在未接受过治疗的病人身上，很少发现有高水平的IgG抗体。
由于没有完全可靠的参考方法来定义一个变应原的敏感性，所以很难定义IgE抗体的绝对诊断灵敏度和特异性。但很多的临床研究，都把IgG抗体检测的结果与体内诊断试验（皮肤测试，吸入抗原或两者）和过敏性疾病家族史做对比。从这些研究中可以很清楚地看到：由于接触抗原与检测的间隔时间不同、变应原种类不同、病人年龄以及受影响的靶器官不同，使得诊断灵敏度有相当大的变化。更重要的是，IgG抗体检测的敏感性与临床敏感性成正比。不考虑变应原或过敏性疾病，对变应原显著过敏的个体，IgG抗体检测的结果可能为阳性，而在具轻微过敏性的个体中可能为阴性。
在不同的变应原系统中，许多研究都支持这样一个结论：对变应原具有轻微过敏的个体，皮肤试验比IgE抗体检测更敏感。然而，也有许多类似的研究表明，用阳性内脏激发试验，皮肤测试里很大一部份的弱阳性不能被确认。这种讨论有点不切实际：对变应原显著过敏的病人，无论皮试还是IgE抗体实验，都很可靠，而对轻微程度的临床过敏，两者都不是完全可靠。
与皮试相比，检测IgE抗体有一定的优势：它方便；对病人没有危险；结果不受药物治疗的影响。除此之外，对某些群体的病人，更应使用IgE抗体检测而不是皮试：如婴幼儿、皮肤划纹症病人或全身性皮肤炎病人。IgE抗体检测也有不足：血清学实验比皮试昂贵而敏感性却不如它，且不能立即出结果。
皮试可用多种变应原，与此相比，多种IgE抗体的检测,所需要的花费却限制了它作为过敏性疾病筛选的用途。近年，人们通过改进IgE抗体的测定方法，发展了多变应原IgE抗体检测，它可能更有效。多变应原IgE抗体检测是在同一试管中，加入多种变应原的免疫吸附剂，或使用已结合多种变应原的吸附剂。多变应原方法分析的敏感性可与单变应原方法相比。对鉴别吸入性变应原导致呼吸道变态反应的孩子，多变应原方法的诊断敏感性比IgE抗体检测更高，46 当然，要证明该实验筛选过敏性疾病的临床用途，还需更多的研究。
变态反应诊断试验的室内评价
随着商业上越来越多地提供有关IgE蛋白质和变应原特异性IgE抗体的检测方法，有关临床实验室和医生办公室报告的结果是否可靠和准确的问题也逐渐增加。使用者对这些问题特别感兴趣：如哪种方法最可靠；不同类型的变应原吸附剂是否对所有变应原都产生相同效果；他们还想知道，一个实验室的结果与别的实验室用相同或不同的分析方法得出的结果相比，在多大程度上是一致的。美国大学的病理学家和美国变态反应、哮喘和免疫学学术联合会，给那些检测IgE蛋白质和变应原特异性IgE抗体的实验室，提出了一个变态反应诊断调查的室内有效检测程序。即每年三次，把已知浓度的IgE蛋白质和变应原特异性IgE抗体标本送给参加实验室，然后分析结果，以得到室内变化的总体估计。每个参加的实验室先得到一份总的结果报告，根据分析方法对该报告进行分类，然后把各实验室结果与别的实验室用相同分析方法得到的结果进行比较。作为一个州总体估计的代表，结果的描述要正确恰当，因为它代表了每个实验室的操作。最后提供的结果表明：商业提供的检测大多数IgE抗体的方法，它们之间还是有很好的一致性。47 而且，约90%的参加实验室检测有效标本时，得到的结果都一致，该有效标本是含抗常见吸入物和食物变应原抗体的标本。至于IgE蛋白质的检测，是用数据表示IgE蛋白质定量测定的合理标准（商业方法间的差异应小于10%），及待测标本在IgE水平上的检测具有很好的一致性（使用相同方法的实验室之间，变异系数为10%-15%）。
变应原特异性IgG抗体：临床应用的分析方法和注释
许多分析方法已被改进成为定量或半定量检测血清抗原特异性IgG抗体的方法。这些方法包括：纯化的放射性标记变应原的免疫沉淀、改进的两位点IMAs和通过观察IgG对IgE的结合抑制情况，而得出IgG浓度的方法。48-51放射性免疫沉淀法需要纯化的放射性标记变应原作为试剂（如：豚草的Amb a 1或蜜蜂毒液的 Api m a），它们还需要已知浓度的纯化的IgG抗体作标准液。典型的测定方法是：把放射性标记的变应原与一系列不同浓度IgG抗体标准一起孵育，接着加入最适浓度的抗人IgG抗血清，产生标记抗原-IgG抗体-抗人IgG的不溶性复合物。洗涤后，沉淀出的抗原量与标准液中的IgG抗体浓度成正比，从中得一标准曲线，可用来定量检测待测血清的IgG。用于检测IgG抗体的两位点IMAs，原理与测量IgE抗体的方法相似，除了在反应的第二阶段使用了标记的抗-IgG抗体（多克隆或蛋克隆）或金葡菌蛋白A，用来检测第一阶段结合在固相变应原免疫吸附剂上的IgG抗体。检测IgG抗体的两位点IMAs不需要单独纯化的变应原蛋白质，可以把变应原混合物（如整个的蜜蜂毒液或豚草花粉变应原）用做固相免疫吸附剂。像前面谈到的放射性免疫沉淀方法一样，它们也要用纯化的IgG抗体标准液来制标准曲线，该标准曲线能把标记的检测蛋白质的结合与待测血清的IgG抗体的浓度联系起来。
几年前，人们就发展了定量检测血清中变应原特异性IgG抗体的方法。用来观察不经肠道的变应原免疫治疗的血清学反应和在某个体身上测到的抗体滴度能否用来决定临床上是否需要进一步治疗，几项临床研究的结果已清楚得表明：过敏性鼻炎和对昆虫毒液高度敏感的病人，在变应原免疫治疗后，血清中IgG抗体的浓度会相应地增高，但目前仍未定义在某个体身上被确认为具有可靠临床地位的血清浓度。52-56这对昆虫毒液过敏的患者来说，是一个很严重的不足，因为，如果他们没有得到足够的治疗，将有过敏性反应的风险。虽然在某些个例中，变应原特异性IgG抗体的检测暗示了个体治疗的血清学反应，但不能用这个结果来决定是否还存在剩余的临床过敏性或决定是否需要进一步的治疗。
IgG亚类蛋白质：临床应用的分析方法和注释
IgG分为四种亚类：IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。由于抗血清试剂和亚类特异性多克隆抗体识别恒定区的不同，每一种亚类分子的γ重链有轻微的不同。57四种亚类在血清中出现的浓度比例是：16：6：2：1。IgG2中最多的是抗多糖抗体，而IgG1和IgG3中最多的是抗蛋白质抗原的抗体。58
IgG亚类蛋白质已由RID，散射测浊法,竞争性替代RIA和两位点IMA定量测定。在整个儿童时代，血清中的IgG亚类蛋白质浓度岁年龄而增加。大约12岁达成人水平（表31-4）。59，60要准确检测小于5岁儿童的IgG2，IgG3和IgG4，需要用RIA或IMA。对许多小于5岁的健康儿童，RIA没有足够的敏感性去检测低浓度的IgG亚类蛋白质。
在各种原发性免疫缺陷疾病中，发现所有IgG亚类的水平都降低，包括各种常见的低γ球蛋白血症，严重的联合免疫缺陷及Wiskott-Aldrich综合症。在一些IgA缺陷的个体中，发现IgG2和IgG4缺乏。单独的IgA缺陷是最常见的Ig缺陷，它通常是无症状的；但在带有重度sinopulmonary感染的IgA缺陷个体中，相应地有IgG2和IgG4缺陷。61.62也有报道说在带有重复的细菌性sinopulmonary感染和otitismedia的儿童中，IgG亚类蛋白质出现选择性的缺乏。IgG2，IgG3和IgG4的单独或联合免疫缺陷都有报道。63.64这些儿童，虽然总的IgG水平正常，但对流感嗜血杆菌B型或肺炎链球菌起反应的特异性抗体都缺乏。对再次出现sinopulmonary感染、总的IgG水平正常或有IgA缺陷的儿童，测定IgG亚类蛋白质可能有用，但描述该结果时应该注意，因为IgG亚类蛋白质浓度减少有可能并不与感染的易感性相关。
IgG4蛋白质和变应原特异性IgG4抗体：临床应用的分析方法和注释
已有好几种方法用于IgG4蛋白质的检测，包括RID，竞争性替代RIA和两位点IMA。65-67成人IgG4的血清浓度是30-1000μg/ml，健康成人中，平均浓度大约是400μg/ml。健康儿童血清中IgG4蛋白质浓度随年龄而变化，大约6-10岁时达成人水平。67对许多健康成人和儿童，RID方法的敏感性不足以检测血清中的IgG4蛋白质浓度。虽然有人提议：IgG4蛋白质浓度高于正常水平可能暗示哮喘儿童prgnosis缺乏，但通过对哮喘儿童的研究，并不能确定IgG4蛋白质水平与抗哮喘治疗反应之间的关系。65，67IgG4浆细胞主要是在与粘膜层相连的淋巴组织中找到,而且, 血清IgG4蛋白质浓度高于正常,通常都是在患慢性呼吸系统疾病（包括哮喘）的成人和儿童身上发现。68
跟检测IgE和IgG一样，两位点IMAs也已用于变应原特异性IgG4抗体的半定量测定。不同的是用标记的抗IgG4抗体做检测蛋白质。对检测出现的抗体滴度和表明血清标本中的抗体浓度，该方法很有用。IgG4异构型抗体在过敏性疾病中很重要，因为这些抗体可能与嗜碱性粒细胞结合，加入到促使致敏细胞释放组胺的行列当中。69它们除了作为可能的皮肤过敏抗体，临床研究还表明：在正常成人和哮喘成人身上，抗常见食物和吸入性变应原（如牛奶、蛋、链格孢属种）的IgG4抗体水平相同。67在哮喘儿童的血清里，抗该类变应原的IgG4抗体比非过敏儿童更普遍。但由于在非过敏儿童身上，也可检测到IgG4抗体，所以，IgG4抗体的出现，对确诊哮喘，并无多大用处。至于滴度测定是否有用，还需更多的研究来证明。作为可能的皮肤致敏抗体，IgG4可能起一个“阻塞”抗体的作用。虽然有此发现，但还没有临床研究表明，检测IgG4抗体对评价免疫治疗的过敏病人有用。70-73
急性过敏反应介质的检测
已有几种分析物被认为是目前或即将发生的急性过敏反应的生物暗示因子，特别是过敏性反应和风疹。最常用的分析物是组胺,N-甲基-4-咪唑乙酸（MIAA，一种组胺代谢物），11-β-前列腺素F2α(一种前列腺素代谢物)和胰酶70-77这些分析物都有共同的特征：由肥大细胞或嗜碱细胞或两者都包含或分泌。肥大细胞被激活后，这些生物因子在血液或尿液中可被检测到或浓度增高。每一种分析物的浓度都很低，但肥大细胞被激活后，在血液或尿液中都可检测到，不过，每种分析物出现和消失的时间都不同。检测可能受干扰，这些干扰限制了实验结果的临床用途。可分别用RIA和汽液色谱法来检测组胺和MIAA。肥大细胞被激活后，不久就会出现组胺，但在15-60min内，有可能检测不到组胺。许多实验室用酸化的24小时尿来测定组胺和MIAA，尿液中，两种分析物的排泄都与肌氨酸酐的浓度相关。尿液中组胺和MIAA的检测受组胺含量丰富的食物干扰，对尿道感染的病人，结果不可靠。尿液里11-β-前列腺素F2α的值还未最后确定，该分析物的诊断用途也未确定。胰酶是肥大细胞被激活的最有用的生物标记。胰酶是一个134，000Mr的中性蛋白酶，在肥大细胞分泌物的所有亚型中都发现有，而且，被释放后，它与肝磷脂或软骨素硫酸盐蛋白多糖结合。胰酶在肥大细胞被激活后30min –1h，在血液中就可达到可检测水平（>1U/L），并能持续存在12h。
细胞免疫实验室方法：淋巴细胞计数和功能评价
免疫反应在术语上是用来描述由淋巴细胞介导的宿主减少各种外来抗原的所有生物反应的总和。它有两部分组成：细胞免疫和体液免疫，即细胞毒素和T淋巴细胞介导的迟发性过敏反应及由B淋巴细胞介导的特异性抗体的合成和分泌。每一型反应都需要有能识别抗原或能激发效应细胞增殖的细胞之间的相互作用。如：由B淋巴细胞转化的浆细胞合成特异性的抗体，首先是单核巨噬系统的抗原提呈细胞开始，然后，巨噬细胞和T淋巴细胞共同作用，产生细胞因子，使B淋巴细胞分化，克隆并产生抗体。在评价免疫系统的整体功能，以及鉴别疾病状态中出现的缺陷或亢进机制时，很有必要对那些起不同功能的细胞进行计数并研究它们在体内的功能。
人类淋巴细胞计数和功能检测，在较长的一段时间里，只有少数具有分离淋巴细胞和检测亚群功能的试剂和技术的研究实验室做。近几年，随着商业的发展和能特异性抗不同功能的淋巴细胞亚群细胞表面糖蛋白的多克隆抗体的产生，这种情形开始发生改变。这些试剂已被广泛地提供，免疫功能的检测也不再神秘。下面几节，我们把用于临床实验室的淋巴细胞计数和淋巴细胞体内功能评价的基本方法，做一综述。
这些实验室方法的结果对异常免疫反应的分类很有用，但只有少数对单独的疾病的本质具有特异性。由于这些实验的诊断特异性有限，在临床上常规使用它们时更要注意。虽然临床调查的数据有限，实验结果在处理免疫系统受影响的特殊疾病的病人时，有用程度也还不清楚，但CD4+T淋巴细胞的计数已用于人类免疫缺陷病毒感染的个体分类中。
淋巴细胞亚群的计数
外周血中存在几种成熟的淋巴细胞亚群。78组成这些亚群的有：具多种不同功能的胸腺淋巴（T）细胞；合成和分泌特异性抗体，来源于淋巴结的（B）淋巴细胞；null细胞（也叫第三群细胞），它参与抗体介导的细胞毒作用及自然细胞毒作用（自然杀伤细胞）。这些亚群是根据结合在细胞膜上的一个或多个糖蛋白而定义的。根据簇设计和表达各种抗原的细胞类型，可以在附录的CD分子表中，找到这些糖蛋白的列表。这些糖蛋白许多都被认为对分子功能很重要。但在T淋巴细胞中，一个单独的细胞表面糖蛋白的出现并不能说明细胞的功能特征。79.80例如，有些带CD8标志的T淋巴细胞是细胞毒细胞，其它的却是抑制/效应细胞。带CD4标志的T淋巴细胞更异质：有些作为诱导细胞促进效应细胞克隆的扩大；有些作为辅助细胞，促进抗体分泌性B淋巴细胞的生长；还有其它的作为抑制/效应细胞或迟发性变态反应的效应因子。80-82
细胞膜表面糖蛋白很有用，因为它使识别和计数具有不同功能的淋巴细胞亚群成为可能。但目前有关T淋巴细胞表面糖蛋白的描述，通常都定义了实行不止一种功能的亚群。带有某一特定糖蛋白标志物的细胞数增加或减少，并不意味那些细胞在体内只实行某一特定功能。由于这个原因，淋巴细胞亚群的计数结果与疾病诊断或对治疗的反应有经验上的联系。而且，这些经验上的关联，在临床上很有用，正如表31-5的例子所证明的那样。
计数血液中淋巴细胞亚群的方法是以多克隆抗体的提供为基础的，这些多克隆抗体能识别单独的细胞表面糖蛋白。典型的操作是：将荧光标记的多克隆抗体与外周血一起孵育，然后在流式细胞仪中计数反应细胞。流式细胞仪是由一个或多个激光源、成像检测器和细胞束（该细胞束能直接通过激光光路）产生装置构成的细胞分析仪（图31-6）。用直角光散射，调节流式细胞仪，可根据淋巴细胞的大小识别淋巴细胞，合适抗体处理细胞后，用直接荧光计数带有特异细胞表面糖蛋白的淋巴细胞。通常用结合不同荧光的两种不同抗体同时计数带有特异性表面糖蛋白的淋巴细胞，该技术叫荧光分析法，它用处很大。当定义了更多的表面标志物的时候，就有可能鉴别和定量在体内仅实行某一单独功能的淋巴细胞亚群。83而且，体内刺激细胞后，通过检测细胞因子的合成，也能确定特异性的细胞亚群在功能上是否完整。使用能通透细胞的试剂，然后用相应的单克隆抗体染色，可检测好几种细胞因子（如肿瘤坏死因子，IL-2，γ干扰素）。84-87
淋巴细胞亚群的计数，也叫T或B细胞表面标志物的分析，由此得到不同类型的结果，见表31-6。每一种淋巴细胞亚群的百分数和绝对数，都应该与健康个体的结果做对比。另外，在典型的分析中，应报告一型与另一型（如辅佐/诱导，抑制/细胞毒细胞比率）的比率。
淋巴细胞体内功能测定
根据对体内细胞生长的激发不同，可以把淋巴细胞功能检测的方法大致分为两大类：抗原特异性和多克隆性。只有以前接触过抗原的个体的细胞，才能被激发出针对特异性抗原的阳性反应，但所有正常个体的细胞，都可被激发出多克隆活性因子的阳性反应。可用抗原，也可用多克隆活性物作激活物，阳性反应表明反应所需的细胞反应和细胞因子都以合适的比例出现。88
抗原特异性迟发性过敏反应，即针对记忆抗原的T淋巴细胞反应，可以通过下列方法常规检测。梯度离心，从外周血中获得单核细胞，将单核细胞与培养孔内不同浓度的检测抗原结合，该培养孔中含生长基质和固定量的细胞。在免疫的个体中，T淋巴细胞识别已被处理的抗原，经激活的巨噬细胞产物白细胞介素-1和T淋巴细胞分泌的生长因子白细胞介素-2的诱导，T淋巴细胞发生增殖。88在培养基中加入放射性核素标记的脱氧核糖核酸（DNA）（3H-胸腺嘧啶脱氧核苷）,就可以检测激活的T淋巴细胞的增殖。通过测定放射性核素与细胞内DNA的结合，可以确定增殖反应的量。与只含培养基不含抗原的培养孔的细胞相比，含抗原的培养孔中生长的细胞内DNA结合的3H-胸腺嘧啶脱氧核苷增加，表明反应呈阳性。不同的免疫个体，增殖反应的程度不同。增殖反应取决于好几个因素,包括体内接触抗原后，过去的时间，个体的年龄和抗原的化学特征。
某些常见抗原（如白色念珠菌和用于诱导特异性免疫的抗原，如破伤风毒素。）对评价个体产生迟发性过敏反应的整体功能是有用的。体内对这些抗原无反应，表明有T细胞参与的细胞介导的免疫缺陷。其他在环境中不常见的抗原，在评价免疫缺陷的作用或某些疾病状态时的特异性迟发过敏反应也有用。例如，已经发现在某些复发弥漫性组织胞浆菌病的病人体内缺乏对组织胞浆菌素抗原的迟发性过敏反应。已有人提到，该异常反映了宿主免疫反应已获缺陷，而宿主免疫反应在允许荚膜组织胞浆菌体内生长中起重要作用。
多克隆激活因子，也叫有丝分裂原，它通过结合细胞膜糖蛋白的碳氢部分，而诱导淋巴细胞的增殖。许多常用的多克隆激活因子取自植物提取物，被称为植物凝集素。不同的植物凝集素以不同的程度刺激不同的淋巴细胞亚群。临床实验室最常用的是刀豆球蛋白A（con A）和植物血细胞凝集素（PHA），它们都能很显著地刺激T淋巴细胞。还有美洲商陆有丝分裂原，在有巨噬细胞出现的情况下，它能刺激培养的T和B细胞。美洲商陆有丝分裂原也叫T细胞依赖性B细胞有丝分裂原。
如前所述，多克隆激活因子与外周血的单核细胞的结合，可评价T或B淋巴细胞的功能随培养基中有丝分裂原的浓度而发生改变，该培养基是含人类血清或胎儿腓肠血清的培养基。测定培养基中生长的细胞内DNA3H的结合情况，可以检测T淋巴细胞的增殖反应。与含人类血清培养基中生长的细胞相比，含ConA或PHA的培养基里生长的细胞内3H增高，表明为阳性反应。由于促有丝分裂原诱导了正常淋巴细胞的多克隆增殖，健康个体的阳性反应比记忆抗原的反应要大得多。
接触了美洲商陆有丝分裂原的B淋巴细胞的增殖和分化成Ig分泌细胞，需要有巨噬细胞和T淋巴细胞产生的细胞因子。检测含促有丝分裂原孔的上清液里的Ig浓度（IgM，IgG和IgA），可以定量检测B淋巴细胞对美洲商陆的反应。通过对比含美洲商陆培养基产生的Igs浓度与含胎儿腓肠血清的培养基中产生的Igs浓度，可检测反应的量。91与前面描述的测定方法的结果不同，它跟T淋巴细胞产生迟发性过敏反应的能力无关，经诱导产生的Ig是用来检测体液免疫的，它对定义那能相互调节以诱导合成和分泌Igs的B淋巴细胞、别的亚群及巨噬细胞的整体功能都很有用。先天性或获得性低丙种球蛋白血症的病人，体内缺乏对美洲商陆有丝分裂原的反应，也有可能是下列原因造成：丙种球蛋白质量异常；B淋巴细胞质量异常或播散性数量；缺乏巨噬细胞或辅佐细胞产生的作用于B淋巴细胞的生长因子；或者是由巨噬细胞或抑制性T淋巴细胞介导的过度抑制。91
淋巴细胞体内功能的检测，在临床上的应用很有限，因为检测需要好几天，花费较高且难标准化。结果虽然对确认某些临床诊断有用，但通常都不能指出在临床上处于怀疑阶段的新的诊断。更重要的是：由于提供给临床医生治疗常见的免疫紊乱的治疗替代物有限，实验室免疫测定的结果通常在决定某一特定治疗方案时，并不重要。虽然有这些限制，但淋巴细胞的体内功能检测得到的数据，对发展免疫疾病的分类几更好理解他们的家族史，对于客观地评价新治疗方法的有效性，都是很重要的。
谢谢合作。
本章讨论临床免疫学实验室用于检测分析物的分析方法，这些分析物在诊断或监测有立即发生的超敏反应或免疫性疾病的病人很有用。通常把这些实验方法总称为免疫化学技术或免疫测定方法，因为它们使用了抗体，抗原，或这两者作为检测试剂。
至于天然抗体，估计一个个体能合成106-108那么多，每一种抗体都有不同的结合特异性。1.2 与抗原相互作用的结合已特异性地把宿主的防御定为目标，在该防御中，抗体起着许多效应分子的功能（如结合补体，皮肤致敏活动）。
抗体作为实验试剂已有很多年了。可以发展专门针对想要抗原的特殊抗体。另外，抗体试剂与抗原相互作用的结合通常具高亲和力，这就使得检测很少量靶抗原成为可能。典型的靶蛋白是：高度纯化的蛋白质、糖蛋白、或这些分子复杂异质的混合物（如豚草属花粉）。
由于抗原结合区与效应分子的功能决定区在不同的区域，所以，免疫球蛋白（Igs）在基因和分子水平实际上是组合结构。例如，把编码某一特定恒定区的基因和许多编码可变区的基因中的任何一个相连，这一特定恒定区介导补体结合的能力能够得以维持同时仍能被精确地定为靶目标。因此，无论是由恒定区基因决定的防御机制，还是由许多可变区基因决定的结合抗原的特异性，Ig的基因家族都成功地保持了恒定。其中，可变区基因在进化期间已增加了很多，同时通过基因复制和体细胞突变，也扩充了许多。3.4
同类抗体（异构型），Ig分子的恒定区中含有共同的肽结构。虽然这些抗体可以与不同的抗原起反应，但在免疫测定中，可以用同一抗体试剂检测他们。例如，与两种不同变应原（如豚草属花粉和猫的毛皮垢屑）起反应的IgE抗体，它们两者都可以用抗-IgE抗体来检测。其中，该抗-IgE抗体能与所有IgE分恒定区的某一肽段特异性地结合（见后）。在这个例子中，虽然每种抗体都有不同的抗原结合位点，但它们的ε重链
恒定区的某一肽段都能与抗-IgE抗体反应。
当设计一个用抗原或抗体作试剂的免疫测定方法时，在选择合适的分析方法方面，最重要的因素是待测物（抗原或抗体）的浓度。临床免疫实验室最常用的免疫化学方法有：（1）凝胶沉淀法和比浊法，用于浓度相对比较高的分析物（毫克到微克每毫升）（2）竞争性替代或免疫测定技术，如放射性免疫测定（RIA）和酶免疫测定（EIA），用于较低浓度的分析物（微克到纳克每毫升）。免疫荧光显微技术，包括流式细胞仪，对检测细胞表面抗原或完整细胞内某些细胞浆或细胞核抗原很有用。各种方法大致的灵敏度限度列在表31-1。如接下来这部分所描述的那样，各种方法最终都是以检测抗原抗体之间的反应为根据
抗原与抗体的结合作用
抗体（Ab）和抗原(Ag)的交互作用与经典的质量动力反应学描述的双分子反应相似：
[Ag]+[Ab]
游离抗原和游离抗体可逆地反应形成抗原-抗体复合物。重排等式可以得到一个亲和力（平衡或结合）常数K：
k=
亲和力常数描述了结合抗原与游离抗原之间的关系，亲和力常数的值越高，表明平衡中有更多的抗原可以与抗体结合形成复合物。亲和力常数可由实验得到。例如，用平衡透析实验可以测出抗溴脱氧尿核苷（BrdU）单克隆抗体的亲和力常数。5
在含定量抗- BrdU抗体的溶液中透析不同浓度的放射性标记的BrdU。由于BrdU可以自由平衡地穿过透析膜，膜两边BrdU的浓度应该是相等的。含抗体一侧的放射性活度有任何的增加都是因为抗体结合了标记的BrdU。通过测定透析膜两边的放射性活度，就可以计算出结合抗原的浓度。这些数据的图解描述在图31-1，A中。含抗- BrdU抗体那一侧中的抗原浓度增加。当反应达到饱和时，结合抗原与抗体的比率达到2，这就是抗体的效价。另外，从第一个等式中可以看到，当一半的结合位点被占据时，[AgAb]=[Ab]和K=1/[Ag]。因此，本例中，在最大结合位点的一半（图31-1，A，y轴=1），由图解可得到K=1X107L/mol。
这个图是非线性的，很难直接从中确定最大结合一半的点。然而，像图31-1，B所示，重新处理数据，可以得到一个线性的表述。这种图解叫Scatchard 图。这条直线斜率的倒数就是亲和力常数的值。X-截距结合交互作用的效价。任何允许检测结合和游离抗原的实验系统，如平衡透析，都可以用来检测亲和力常数。
亲和力常数的知识对预测某一特殊抗体能否用来检测某一特定范围浓度的抗原很有用。例如，在前面描述的亲和力常数为107L/mol的抗- BrdU抗体的例子中，当BrdU抗原的浓度在10-7mol/L或30ng/ml范围时，抗体结合位点的一半被占据。
上述讨论是有关单克隆抗体的，还举了一个真正的双分子交互作用，在这个反应中，Scatchard 分析可以准确地估计亲和力常数。然而，多克隆抗血清与抗原的交互作用很显然不是真正的双分子反应。当免疫系统中出现抗原时，很多位点都被看成具有抗原性。因此，在结合位点方面，很多抗原都被认为是多效价的，而且能与多种不同抗体反应。另外，在任何一个单独的抗原性位点上，许多不同抗体都可以与之反应，且各抗体的反应都有轻微的不同，那么各抗体就都有不同的亲和力。由于多位点结合反应每一个都有不同的亲和力，抗血清与复杂抗原的Scatchard图表通常都不是线性的。在低抗原浓度时，高亲和力抗体决定直线的斜率，而在高抗原浓度时，由更丰富的低亲和力抗体支配曲线。这种情况，可以用直接结合图表来确定平均亲和力常数，把它作为抗体一半饱和时相应的抗原浓度（看图31-1，A）。
多价抗原与多克隆抗血清的结合作用不能用同样的方法用数学的方法定义亲和力常数，而是用相对不那么精确的术语亲和力来描述它们之间的相互作用。亲和力受抗原的效价及抗血清中每一种抗体的影响。多效价的结合作用很复杂，因为与一个位点的结合通常都会影响到同一分子中与别的抗原性位点的结合。多效价通常产生积极的合作效应，即一个位点的结合会促进与第二个位点的结合，最终的亲合力比各抗原-抗体相互作用的亲和力的总和要大。人们体会到这种合作效应是因为他们注意到多克隆抗体的亲和力一般小于108L/mol，而单克隆抗血清的亲和力超过1011L/mol。
免疫测定中抗原抗体作为反应物的定量
通过使用免疫方法测定抗原和抗体间的结合，可以检测出溶液中抗原和抗体的浓度。临床实验室最常用的免疫测定技术可以分为两类。第一类是敏感度相对来说不那么高的技术，它包括以光散射和凝胶沉淀为原理的方法，这些方法中，抗体和抗原结合后发生生物物理学变化，然后产生信号（如形成沉淀）。第二类技术包括RIA、EIA、荧光免疫测定和化学发光免疫测定，在检测抗体与抗原间的结合时，这些方法需要用放射性核素，酶，荧光或能发光的分子修饰抗原或抗体试剂。不论哪一种技术，为定量检测浓度而转换结合信号时都要求使用标准曲线，该标准曲线中，加的是已知量的反应物。
使用光散射来检测单克隆抗体与可溶性抗原的结合就说明了这个原理。6抗原和抗体在溶液中相互作用后形成分子复合物，该复合物比两种反应物的分子量都要大。光散射强度与分子量的平方成比例，7可以把抗原抗体复合物的形成描述为有更多的光散射，而不是由各蛋白质产生的光散射的总和。例如，将含单克隆抗体的溶液放置于比浊计中，然后加入递增量的抗原。抗原-抗体复合物产生光散射的增量比抗原抗体单独产生的光散射要大（图31-2）。光散射图的转折点出现在抗原与抗体的克分子浓度比等于2的地方。在这一点，抗体与抗原的反应达到饱和，因为每个IgG抗体分子都有两个结合位点。低于饱和点的任何一处，都有一个唯一的光散射信号与抗原浓度相对应。用已知浓度的抗原溶液可以得到光散射信号的强度，进而得出标准曲线。如果检测一个未知的标本，产生一个光散射信号y，那么从标准曲线就可定义出抗原的浓度等于x（看图31-2）。所有的定量免疫测定都遵循下列原则。那就是（1）抗原-抗体复合物的量与被结合的抗原量成比例，（2）信号（如光散射）与抗原抗体复合物的量成比例，（3）用已知浓度的抗原标准化信号，（4）用标准曲线把信号转换成浓度检测。
实践中，本例描述的散射光信号很小以致于它仅用于检测纯化的单克隆抗体和纯化的抗原之间的结合作用。血清中别的蛋白质的散射光背景会掩盖抗原-抗体复合物的散射光。抗体与抗原结合后会出现内在的变化，因此，大多数以此为原理的免疫测定方法都会使用多克隆抗血清，并以抗原-抗体的沉淀反应为原理。因为大多数抗原都有好几个可以被抗体识别和结合的位点，大多数抗血清也含有好几种可以识别同一抗原分子不同结构的抗体。因此，在典型的抗原-抗体反应中，一个单独的抗原可以有很多的抗体结合到它的表面。由于每种抗体分子都有两个结合位点，那么与第一个抗原结合的抗体都可以再与另一个相同的抗原结合，而每个抗原分子又可能有许多的抗体与之结合。这种交叉结合（或交叉连接）的现象导致了大量的不可溶的抗原抗体复合物的形成，该复合物叫晶格（图31-3，A）。晶格的形成是由于抗体双价的结合结构以及抗原多结合位点的出现。抗原过量时，抗体被饱和，没有足够的抗体与复合物交叉连接（图31-3，B）。抗体过量时，抗原被抗体饱和，没有足够的抗原与复合物交叉连接（图31-3，C）。使用单克隆抗体而不是多单克隆抗血清时，每个抗原只能与一个单独的位点结合，不会有交叉连接（或晶格形成）出现（图31-3，D）。
沉淀反应是最早被描述的抗原抗体反应之一。8.9可以在某种介质如琼脂里进行反应，琼脂允许蛋白质分子扩散或电泳但大的，不溶性的抗原-抗体复合物却不行。以琼脂为基础，最常用的定量免疫化学技术是放射免疫扩散（RID）。10 RID是最简单可靠的免疫测定技术之一，但它也有有一些缺点。沉淀反应发展缓慢，有时需要好几天才能得出结果。单独一个测定，能被分析的未知的东西很有限，且此技术相对来说灵敏度不是很高。进行RID时，先在玻璃板上铺一薄层琼脂，整个琼脂内均匀地含有溶解的抗体试剂。在琼脂中央打一小孔，孔里放置（标准或未知的）抗原，接着抗原在琼脂内扩散，形成一个浓度梯度。抗原在琼脂内移动时，被抗体结合，但在孔附近的抗原过量带，抗原-抗体复合物仍保持可溶。抗原和抗原-抗体复合物继续扩散，直到等价带中有足够的抗体被结合形成抗原-抗体复合物晶格。等价带中形成的沉淀在含抗原的孔周围形成环状。标本中抗原浓度越高，等价带中需要的抗体越多，沉淀环的直径越大。沉淀环的平方（即面积）与抗原的浓度成正比。
典型的RID测定是：把抗体加入到融化的琼脂中，然后把琼脂倒在一玻璃载玻片上，让它凝固。在凝胶中打孔，各孔中分别加入未知标本和一系列已知浓度的抗原标准物。将载玻片置于湿的温箱中孵育30分钟到2小时，然后就可以测定沉淀环的直径（图31-4）。RID不需要特殊仪器，临床上许多小的实验室都使用该技术。
也可用比浊法来对沉淀反应进行定量。比浊法比凝胶技术更敏感、更快速，且能自动化。如前边所提到的，比浊法检测的是被散射的光，散射光的强度与溶液形成的抗原-抗体复合物的分子量的平方成比例。在终点（平衡）比浊法中，抗原和抗体孵育30分钟到2小时，测定散射光，将它和标准曲线对比，该标准曲线上的散射光与抗原浓度相对应。在速率比浊法中，抗原与抗体混合后，在很短的一段时间内，立即检测多个散射光，通过这样，可以测定出抗原-抗体复合物形成的起始速率。散射光形成的速率越快，表明抗原抗体复合物形成的速率越快和抗原的浓度越高。比浊免疫分析法快速、可靠、容易实现自动化。利用商业提供的设备和抗体试剂，许多蛋白质都可以在临床实验室常规检测。自动化的比浊法也可用于血清Igs(包括IgE),白蛋白,C3,C4, 转铁蛋白, α1抗胰蛋白酶,C反应蛋白,C1 酯酶抑制因子的定量检测;尿液中肌球蛋白和白蛋白水平的测定;以及脊柱液中IgG和白蛋白水平的检测。
第二类免疫测定需要用一种“通讯群体”对反应物（抗原或抗体）中的一个进行修饰。放射性核素，酶，荧光染料或发光的分子都可用做出现了抗体结合抗原的信号。这些方法在技术上实施起来更困难，但它们都是必要的，因为生物标本中微量（ng/ml）抗原或抗体的检测和定量都要求更高的灵敏度。最先描述RIA的原理是1960年胰岛素的测定，而且这门技术是灵敏度最高的技术之一。11 典型的竞争性替代RIA中：先放射性标记抗原，然后将标记抗原与抗体一起孵育，再把与抗体结合的标记抗原与未结合的抗原分离，最后检测已结合的放射性活度。如果在加入标记抗原的同时也加未标记的抗原，未标记抗原就会竞争有限的抗体结合位点，与被提供的抗体结合的标记抗原就变少。试管里含固定量的标记抗原和抗体，如果往里加入递增浓度的未标记抗原，就可构建一条标准曲线。这种方法叫竞争替代法因为抗体试剂的量不足以结合所有标记和未标记的抗原分子。做这个实验时，临床医生一定要有特异性的抗血清或单克隆抗体，纯化的放射性标记的抗原，纯化的未标记的抗原标准物，以及分离结合跟游离抗原的方法。多数RIAs都是用125I放射活性通讯群体，用γ闪烁记数仪检测发出的放射性活度。由于具有敏锐的分析灵敏度，RIAs的用处很大，但由于放射性核素的使用，它们的放置时间又很短。最常见的分离技术是使用第二抗体，该抗体能跟第一抗体反应形成沉淀。已结合的放射性标记的抗原跟复合物一起沉淀下来，通过离心分离结合和游离的放射性活度。最近，已设计出一些使用固相结合抗体的方法（图31-5，A）。这些方法中，抗体结合于固相表面，如试管内壁或聚苯乙烯珠粒。往试管里加入标准或未知抗原以及放射性标记抗原后，通过简单地倾倒试管或移走珠粒就可分离结合和游离抗原。
固相结合抗体的使用引致了“三文治”免疫测定的发展，也叫两位点免疫测定方法（IMAs）。在这一类型的方法中，临床医生纯化和放射性标记第二抗体而不是标记纯化的抗原。第一抗体与固相结合，然后加入抗原，最后通过加入放射性标记的第二抗体，该抗体也能与抗原结合，就可以检测与固相结合的抗原。随着更高浓度的的抗原标准物的加入，更多的标记抗体与固相结合，从而形成一条标准曲线（图31-5，B）。免疫放射测定（IRMA）技术的优点是标记的是纯化的抗体而不是纯化的抗原。抗体是稳定的蛋白质分子，容易被放射性核素、酶和能发光的分子标记上。但有些抗原在化学标记过程中却有可能被改变或遭到破坏。
如前所述，两位点IMA的基本原理是可以使用多种通讯群体。也就是说，除了使用放射性核素标记的第二抗体，第二抗体还可与酶或发光分子结合，然后用分光光度计或发光计而不是用γ闪烁记数仪来定量检测结合抗体。如果用的是酶标记，该方法叫EIA。典型的EIA是通过加入底物溶液来定量检测已结合的酶连第二抗体，该底物被酶水解后颜色发生改变。因此，加入到试管里的抗原越多，被结合的酶连二抗也越多，同时，在给定的时间内，颜色强度的变化也越大。许多EIAs都用微量滴定板进行，然后用自动分光光度计定量，该分光光度计能直接读取多孔板的吸光度。EIAs有好几个优点：不使用同位素，试剂有较长的放置时间，没有废物处置问题。三文治EIA方法的分析灵敏度与竞争性替代RIA相近。
检测IgE蛋白和抗原特异性IgE抗体的免疫化学方法
临床上评价过敏性疾病时，就已确定了IgE蛋白质（IgE）和抗原特异性IgE抗体（IgE抗体）的实验室值。多种分析方法用于检测体液中的IgE和IgE抗体。
IgE蛋白：分析方法和正常值
下列方法均可用于血清中IgE的测量：（1）琼脂免疫扩散，（2）琼脂糖RIA，用放射性标记的第二阶段的抗血清检测沉淀，（3）竞争性替代RIA，（4）两位点IRMA和两位点EIA，12-15（5）动力比浊法。免疫扩散技术还没有足够的灵敏度检测正常血清或分泌物的IgE，所以这些方法还不适于临床应用。
RIA，两位点EIA和动力比浊法可以检测血清中浓度低至0.5U/ml(1.2ng/ml)的IgE，以方便的两位点免疫测定技术为原理的试剂盒在商业上已有提供。检测IgE的IMA遵循下列原则：与固相共价结合的多克隆或单克隆抗-IgE抗体与血清或标准液一起孵育，在固相孵育期间检测结合的抗体，该固相上带有放射性标记的，经亲和力层析纯化了的单克隆抗体，或带有与酶连接的抗-IgE抗体。与标准曲线对比，可以计算出血清IgE的浓度。对临床实验室常规使用的方法来说，IgE检测的最大灵敏度是7.5-50 U/ml（18-120 ng/ml）。更低浓度的IgE可以用IMA法检测，但与检测更高浓度相比，IMA在检测0.5-4 U/ml这个浓度范围时，它的可靠性已大大减少。临床上已有大量的研究是关于正常（非过敏性）个体血清中IgE浓度。不同的检测技术在成人和儿童身上产生的结果有轻微的不同。12-15 尽管有差异，但在IgE水平随年龄的发展方面，以及不考虑检测技术，在健康成人身上观察到的IgE浓度的频率分布方面，都存有一致的趋势。健康成人IgE浓度的频率分布明显地不对称，它的95百分位限度很宽，还有一个不成比例的大量的低IgE值。因此，在计算正常的95百分位限时，很多观察者都用对数转换来处理他们的数据，通过这样得到正常值上限，这些上限与几何平均值（表31-2）相比，表面上看起来非常高。当用正常值的上限（一般是平均值+ 2标准差）来鉴定过敏性个体时，这些高的正常值上限降低了血清IgE实验作为临床变态反应筛选实验的诊断灵敏度。
儿童IgE的血清浓度随着儿童的成长而缓慢地增加，大约5-7岁的时候达到成人水平。15.16同龄男孩和女孩的IgE水平是相同的。与低于40岁的成人相比，年龄超过70岁的个体，IgE水平有下降的趋势。17
作为过敏性疾病诊断试验的血清IgE水平，在评述它的有效性时，单独讨论它在儿童和成人身上的使用是正确的。出生或婴儿期间，血清IgE水平增高，通常较早就会有临床变态反应发生。18 Kjellman18 发现，在年龄的95百分位限度以上，在双亲都有过敏性疾病家族史的孩子中，75%的孩子血清IgE水平都增高。在一给定年龄且IgE水平比平均值高出一个标准差的健康孩子，与具有较低IgE水平的群体相比，前者在随后的18个月期间发生过敏性疾病的事件要比后者多十倍。
婴儿过敏性疾病的诊断很复杂，因为这个年龄的群体，鼻漏是过敏反应最常见最开始的表现，但婴儿期间，上呼吸道感染也很常见，有可能无法在临床上将它与鼻炎区分开来。 对婴儿，IgE的测定很有价值，因为当假定的临床诊断完全不同时，它可以提示医生有可能是过敏性疾病。这种情况下，血清IgE水平超过20 U/ml支持过敏性疾病的诊断，19 但在婴儿期间或以后的生活里，血清IgE水平正常，并不能排除过敏性疾病的诊断；事实上，在排除过敏性疾病的诊断时，应该把别的试验诊断结果，如皮肤测试和IgE抗体检测都考虑进来。有时候，过敏性疾病的出现信号很清楚（如具有先天性过敏症家族史的婴儿出现湿疹和鼻炎），对于临床上这种情况，几乎不用血清IgE水平来提供额外的信息。
对大一点的儿童，情况相似。当把正常范围的上限做为诊断临界值时，血清IgE蛋白质的测量已经限制了过敏性疾病的诊断灵敏度。一般，对好几种变应原具高敏性以及带有多种过敏性疾病的孩子，有增高的血清IgE水平；而那些只对少数变应原过敏以及只有少数内脏被涉及的孩子，血清IgE水平通常都正常。临床上，有些孩子对大量变应原都过敏，在他们身上，诊断灵敏度最大。20
具有先天性过敏症的孩子，皮肤表现的疾病出现和胃肠道症状的出现，表明血清IgE水平增高的可能性很大。也有证据表明，对花粉变应原过敏的孩子，血清IgE水平增高的频率，比对尘螨和霉菌变应原过敏的孩子要大；过敏性疾病牵涉到多个靶器官的孩子，血清IgE水平的增加，也比疾病更有限的孩子要高；极度增高通常在带有皮肤表现的病人身上出现。对过敏性疾病，IgE水平增高的诊断特异性非常好。事实上，两者间的联系很紧密，以致于有时候那些无症状但IgE水平增高的孩子被称为预过敏的，这反映了他们会发展到临床变态反应体征的假定。
对于怀疑有过敏性疾病的成人，血清IgE蛋白质的检测在诊断用途上比较有限。成人呼吸系统变态反应的研究结果表明，大约50%的外源性哮喘病人和低于5%的所谓内源性（非特应性变态反应的）哮喘病人有血清IgE水平的增高。14对一种或少数几种变应原过敏的哮喘病人通常血清IgE水平正常。对成人，最高的IgE水平通常出现在对好几种变应原都过敏，而且合并哮喘，皮肤炎和鼻炎人身上。与儿童的情况一样，当过敏性疾病的诊断不是很明确的时候，血清IgE水平有限的诊断敏感性限制了IgE测量在这种情况下的临床用途。但并不是说，这种情况就不需要测定血清IgE，因为血清IgE水平增高表明发生过敏性疾病的可能性更大。
血清IgE水平的显著升高还与过敏性支气管肺麴菌病有关。21该病通常在外源性哮喘病人身上出现，持续时间长。急性肺部浸润期间，每一个过敏性麴菌病病人的早期，都会出现血清IgE水平的增高，但在疾病的发展过程中，血清IgE水平可能会出现比较大的波动。在活动性肺疾病的病人身上发现血清IgE水平正常，实际上可以排除该诊断。
抗原特异性IgE抗体：分析方法和结果报告
有两种方法用来检测抗原特异性IgE抗体：（1）IgE抗体检测，前面称为放射免疫吸附试验（2）淋巴细胞组胺释放试验。首次描述淋巴细胞组胺释放试验是在50多年以前，随后它被改进和自动化。22-25先用葡聚糖沉淀法分离外周血淋巴细胞，洗涤，用含钙和镁离子的缓冲液悬浮。往洗涤过的固定量的淋巴细胞中，加入不同浓度的变应原提取物，混合物在37℃孵育一小时。4℃冷却试管以终止反应，通过离心分离细胞。变应原与结合在细胞上的IgE抗体发生反应后，嗜碱细胞释放组胺至上清液，先用丁烷再用酸提取组胺。可用荧光分光光度计或RIA方法检测提取物中的组胺浓度。26.27手工操作的荧光分光光度计法，可检测大约1ng的组胺。RIA法更敏感。用细胞释放的组胺占组胺总浓度的百分比来表示结果，将未接触过变应原提取物的淋巴细胞溶于高氯酸，然后在该细胞溶解产物中检测组胺的总浓度。
淋巴细胞组胺释放试验详细说明了结合在细胞上的IgE抗体的特异性，也表明了释放介导因子的机制在功能上的完整。大约15%的个体，他们的淋巴细胞在体内不释放组胺。28尽管已发展了自动化系统来检测组胺，但组胺释放试验的临床应用仍然有限，因为它要求使用新鲜血液，而且，仅单独使用血液的一部份就能检测出的变应原也很有限。29还有，用这些方法测定组胺时，存在相当大的室内实验室差异。30
IgE抗体检测是一个双位点IMA。31该方法的第一阶段：IgE抗体待测的血清标本与固相结合的变应原免疫吸附剂反应。第二阶段：2-4小时后，冲掉没有抗体的血清部份，变应原与放射性标记或酶标，及经亲和力层析法纯化的抗体或单克隆抗-IgE抗体一起孵育。第二阶段的抗-IgE抗体与变应原免疫吸附剂的结合，可以检测在第一阶段被结合的抗体。
IgE抗体检测并没有测出IgE抗体的实际浓度。许多过敏性个体的血清，含的抗体浓度都超过变应原免疫吸附剂的结合能力，因而第一阶段孵育的上清液中，含有过剩的IgE抗体。32而且，由于大多数变应原都是复杂的蛋白质或糖化蛋白，所以，各血清包含的是能以不同的亲和力与变应原反应的抗体混合物。而且，在一限定的范围，第二阶段抗体的结合与血清里的IgE抗体浓度成比例。这层关系已在用校正的标准曲线定量测定IgE抗体的研究应用中被用到。33.34然而，由于常规的IgE抗体检测，IgE抗体通常都过量，第二阶段抗体的结合不仅反映了待测抗体的量，还反映了它的亲和力，因此，结果是半定量的（见后）。
正如前面Wide等人31描述的那样，IgE抗体检测使用了与交联匍聚糖珠粒共价结合的变应原。随后人们又使用了各种别的固相材料，34.35包括纤维素载体，微晶纤维素颗粒，琼脂糖珠子，滤纸，多聚乙烯小杯或微量滴定孔。这些固相材料大多都是带有游离氢氧根的多醣类，该氢氧根能与溴化氰反应形成稳定的咪多卡中间物。36后者与蛋白质变应原的氨基部份反应形成共价键。与多聚乙烯孔或小杯的结合是非共价吸附。临床实验用时，变应原免疫吸附应该含有原始变应原提取物的所有免疫源性成份，并且与复杂的变应原具相同比例。虽然监测蛋白质与固相发生化学结合，相对来说比较容易，但在不同的变应原系统，很少有这样一些数据提供，即能够表明所有的相关变应原都被结合上了。Alternaria变应原已被具体地研究过，吸附研究表明，所有相关的免疫源性成份都被结合到了固相免疫吸附剂上。用固相免疫吸附剂吸附10个Alternaria过敏病人的血清，该血清池的皮肤致敏活性将丧失。37确保所有相关变应原都与固相免疫吸附剂结合上的另一方法就是，用含变应原的溶液与化学活化的微粒子免疫吸附剂结合。38冲洗，悬浮吸附试剂，从对还在疑问当中的变应原过敏的几个个体中得到血清，然后用这些不同量的血清来检测，从而得到一系列剂量反应曲线。当所有的变应原都固相免疫吸附剂结合后，剂量反应曲线变平。这点之前制备的各免疫吸附剂搭配后产生最终的固相免疫吸附剂。
如前所述，商业上已提供了好几种类型的变应原免疫吸附剂（表31-3）。商业提供的最普遍的是使用纤维载体或免疫吸附盘，但小杯型的免疫吸附剂如微量滴定孔，也有提供。无论使用哪一型试剂，在技术上都很方便。因为在测定过程中，不需要离心。试剂一旦配置好，都很稳定。
IgE抗体检测的分析灵敏度部份是由第二阶段使用的标记的抗-IgE抗体决定。商业上放射性标记、亲和力层析纯化的抗-IgE抗体作为蛋白质的检测，效果很好，可以定量检测ng的IgE抗体。39为了循环使用放射性标记的抗-IgE抗体，商业制造商已发展了使用酶连抗体的免疫方法。这些方法的分析特征跟旧的RIA方法相似。放射性标记的单克隆抗体在商业上也有提供。
几乎所有的常见变应原（包括动物上皮细胞，食物，霉菌，尘，昆虫毒液，一些药物，以及牧草、野草和树木的花粉）都被提供用于IgE抗体的检测。大多数药物都低分子量的复合物，没有游离的氨基部份，不会与溴化氰活化的固相起反应。然而，有些低分子量的药物，如胰岛素，却能与之结合并制成令人满意的免疫吸附剂。至于盘尼西林，Penicilloyl可以与Polylysine或蛋白质载体结合，后者又可与活化的固相结合，以用于IgE抗体的检测。40还没提供有类似的试剂，用于检测这类IgE抗体的检测，即抗所谓的盘尼西林微量抗原性决定物，该物质可能与一些急性过敏反应有关。41
如更前面所谈到的，IgE抗体检测不是定量的免疫测定，结果的描述也很复杂，因为有好几种公式可以用来给结果记分和报告结果。大多数商业上提供的、以结果的得分情况为根据的方法，都是以与病人剂量反应曲线数据做对比为根据。两种方法最常用：把一系列阳性质控物的稀释液与变应原免疫吸附剂一起孵育，得到参考曲线；或用结合抗-IgE抗体的免疫吸附剂去捕获标准液中的IgE，该标准液中一已知量的IgE蛋白质。（如25U/ml）。无论哪一种情况，都要定义一个阈值，用来表示IgE与固相的非特异性结合（阴性）和gE与免疫吸附剂的变应原特异性结合（阳性）之间的临界值。定量表示结果可以用单位/毫升，半定量表示是从0级（阴性）- 6级（强阳性），或用比率来表示：待测血清的结合跟同一方法检测到的非过敏个体血清池的结合相比。理论上，最后这种方法比较合适，因为不可能假设每一个抗体-变应原系统都产生相同的剂量反应曲线。
除了随机误差，还有别的原因导致IgE抗体检测的结果有误。IgE蛋白质水平增高的血清和许多变应原免疫吸附剂一起检测的时候，由于非特异性结合的增加，血清会产生临界或弱阳性结果。IgE浓度低于1000 U/ml时不会出现这种现象，除非把阴性和阳性的分界点设在很低的水平。42由于IgG抗体对IgE抗体结合的抑制，可能出现假阴性结果。43IgG抗体的亲和力与IgE抗体相似，而且，在免疫治疗中的病人身上，通常以ng/ml的浓度出现。44IgE抗体的检测，对判定已接受治疗的病人身上是否还有临床过敏性存在作用不大，在未接受过治疗的病人身上，很少发现有高水平的IgG抗体。
由于没有完全可靠的参考方法来定义一个变应原的敏感性，所以很难定义IgE抗体的绝对诊断灵敏度和特异性。但很多的临床研究，都把IgG抗体检测的结果与体内诊断试验（皮肤测试，吸入抗原或两者）和过敏性疾病家族史做对比。从这些研究中可以很清楚地看到：由于接触抗原与检测的间隔时间不同、变应原种类不同、病人年龄以及受影响的靶器官不同，使得诊断灵敏度有相当大的变化。更重要的是，IgG抗体检测的敏感性与临床敏感性成正比。不考虑变应原或过敏性疾病，对变应原显著过敏的个体，IgG抗体检测的结果可能为阳性，而在具轻微过敏性的个体中可能为阴性。
在不同的变应原系统中，许多研究都支持这样一个结论：对变应原具有轻微过敏的个体，皮肤试验比IgE抗体检测更敏感。然而，也有许多类似的研究表明，用阳性内脏激发试验，皮肤测试里很大一部份的弱阳性不能被确认。这种讨论有点不切实际：对变应原显著过敏的病人，无论皮试还是IgE抗体实验，都很可靠，而对轻微程度的临床过敏，两者都不是完全可靠。
与皮试相比，检测IgE抗体有一定的优势：它方便；对病人没有危险；结果不受药物治疗的影响。除此之外，对某些群体的病人，更应使用IgE抗体检测而不是皮试：如婴幼儿、皮肤划纹症病人或全身性皮肤炎病人。IgE抗体检测也有不足：血清学实验比皮试昂贵而敏感性却不如它，且不能立即出结果。
皮试可用多种变应原，与此相比，多种IgE抗体的检测,所需要的花费却限制了它作为过敏性疾病筛选的用途。近年，人们通过改进IgE抗体的测定方法，发展了多变应原IgE抗体检测，它可能更有效。多变应原IgE抗体检测是在同一试管中，加入多种变应原的免疫吸附剂，或使用已结合多种变应原的吸附剂。多变应原方法分析的敏感性可与单变应原方法相比。对鉴别吸入性变应原导致呼吸道变态反应的孩子，多变应原方法的诊断敏感性比IgE抗体检测更高，46 当然，要证明该实验筛选过敏性疾病的临床用途，还需更多的研究。
变态反应诊断试验的室内评价
随着商业上越来越多地提供有关IgE蛋白质和变应原特异性IgE抗体的检测方法，有关临床实验室和医生办公室报告的结果是否可靠和准确的问题也逐渐增加。使用者对这些问题特别感兴趣：如哪种方法最可靠；不同类型的变应原吸附剂是否对所有变应原都产生相同效果；他们还想知道，一个实验室的结果与别的实验室用相同或不同的分析方法得出的结果相比，在多大程度上是一致的。美国大学的病理学家和美国变态反应、哮喘和免疫学学术联合会，给那些检测IgE蛋白质和变应原特异性IgE抗体的实验室，提出了一个变态反应诊断调查的室内有效检测程序。即每年三次，把已知浓度的IgE蛋白质和变应原特异性IgE抗体标本送给参加实验室，然后分析结果，以得到室内变化的总体估计。每个参加的实验室先得到一份总的结果报告，根据分析方法对该报告进行分类，然后把各实验室结果与别的实验室用相同分析方法得到的结果进行比较。作为一个州总体估计的代表，结果的描述要正确恰当，因为它代表了每个实验室的操作。最后提供的结果表明：商业提供的检测大多数IgE抗体的方法，它们之间还是有很好的一致性。47 而且，约90%的参加实验室检测有效标本时，得到的结果都一致，该有效标本是含抗常见吸入物和食物变应原抗体的标本。至于IgE蛋白质的检测，是用数据表示IgE蛋白质定量测定的合理标准（商业方法间的差异应小于10%），及待测标本在IgE水平上的检测具有很好的一致性（使用相同方法的实验室之间，变异系数为10%-15%）。
变应原特异性IgG抗体：临床应用的分析方法和注释
许多分析方法已被改进成为定量或半定量检测血清抗原特异性IgG抗体的方法。这些方法包括：纯化的放射性标记变应原的免疫沉淀、改进的两位点IMAs和通过观察IgG对IgE的结合抑制情况，而得出IgG浓度的方法。48-51放射性免疫沉淀法需要纯化的放射性标记变应原作为试剂（如：豚草的Amb a 1或蜜蜂毒液的 Api m a），它们还需要已知浓度的纯化的IgG抗体作标准液。典型的测定方法是：把放射性标记的变应原与一系列不同浓度IgG抗体标准一起孵育，接着加入最适浓度的抗人IgG抗血清，产生标记抗原-IgG抗体-抗人IgG的不溶性复合物。洗涤后，沉淀出的抗原量与标准液中的IgG抗体浓度成正比，从中得一标准曲线，可用来定量检测待测血清的IgG。用于检测IgG抗体的两位点IMAs，原理与测量IgE抗体的方法相似，除了在反应的第二阶段使用了标记的抗-IgG抗体（多克隆或蛋克隆）或金葡菌蛋白A，用来检测第一阶段结合在固相变应原免疫吸附剂上的IgG抗体。检测IgG抗体的两位点IMAs不需要单独纯化的变应原蛋白质，可以把变应原混合物（如整个的蜜蜂毒液或豚草花粉变应原）用做固相免疫吸附剂。像前面谈到的放射性免疫沉淀方法一样，它们也要用纯化的IgG抗体标准液来制标准曲线，该标准曲线能把标记的检测蛋白质的结合与待测血清的IgG抗体的浓度联系起来。
几年前，人们就发展了定量检测血清中变应原特异性IgG抗体的方法。用来观察不经肠道的变应原免疫治疗的血清学反应和在某个体身上测到的抗体滴度能否用来决定临床上是否需要进一步治疗，几项临床研究的结果已清楚得表明：过敏性鼻炎和对昆虫毒液高度敏感的病人，在变应原免疫治疗后，血清中IgG抗体的浓度会相应地增高，但目前仍未定义在某个体身上被确认为具有可靠临床地位的血清浓度。52-56这对昆虫毒液过敏的患者来说，是一个很严重的不足，因为，如果他们没有得到足够的治疗，将有过敏性反应的风险。虽然在某些个例中，变应原特异性IgG抗体的检测暗示了个体治疗的血清学反应，但不能用这个结果来决定是否还存在剩余的临床过敏性或决定是否需要进一步的治疗。
IgG亚类蛋白质：临床应用的分析方法和注释
IgG分为四种亚类：IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。由于抗血清试剂和亚类特异性多克隆抗体识别恒定区的不同，每一种亚类分子的γ重链有轻微的不同。57四种亚类在血清中出现的浓度比例是：16：6：2：1。IgG2中最多的是抗多糖抗体，而IgG1和IgG3中最多的是抗蛋白质抗原的抗体。58
IgG亚类蛋白质已由RID，散射测浊法,竞争性替代RIA和两位点IMA定量测定。在整个儿童时代，血清中的IgG亚类蛋白质浓度岁年龄而增加。大约12岁达成人水平（表31-4）。59，60要准确检测小于5岁儿童的IgG2，IgG3和IgG4，需要用RIA或IMA。对许多小于5岁的健康儿童，RIA没有足够的敏感性去检测低浓度的IgG亚类蛋白质。
在各种原发性免疫缺陷疾病中，发现所有IgG亚类的水平都降低，包括各种常见的低γ球蛋白血症，严重的联合免疫缺陷及Wiskott-Aldrich综合症。在一些IgA缺陷的个体中，发现IgG2和IgG4缺乏。单独的IgA缺陷是最常见的Ig缺陷，它通常是无症状的；但在带有重度sinopulmonary感染的IgA缺陷个体中，相应地有IgG2和IgG4缺陷。61.62也有报道说在带有重复的细菌性sinopulmonary感染和otitismedia的儿童中，IgG亚类蛋白质出现选择性的缺乏。IgG2，IgG3和IgG4的单独或联合免疫缺陷都有报道。63.64这些儿童，虽然总的IgG水平正常，但对流感嗜血杆菌B型或肺炎链球菌起反应的特异性抗体都缺乏。对再次出现sinopulmonary感染、总的IgG水平正常或有IgA缺陷的儿童，测定IgG亚类蛋白质可能有用，但描述该结果时应该注意，因为IgG亚类蛋白质浓度减少有可能并不与感染的易感性相关。
IgG4蛋白质和变应原特异性IgG4抗体：临床应用的分析方法和注释
已有好几种方法用于IgG4蛋白质的检测，包括RID，竞争性替代RIA和两位点IMA。65-67成人IgG4的血清浓度是30-1000μg/ml，健康成人中，平均浓度大约是400μg/ml。健康儿童血清中IgG4蛋白质浓度随年龄而变化，大约6-10岁时达成人水平。67对许多健康成人和儿童，RID方法的敏感性不足以检测血清中的IgG4蛋白质浓度。虽然有人提议：IgG4蛋白质浓度高于正常水平可能暗示哮喘儿童prgnosis缺乏，但通过对哮喘儿童的研究，并不能确定IgG4蛋白质水平与抗哮喘治疗反应之间的关系。65，67IgG4浆细胞主要是在与粘膜层相连的淋巴组织中找到,而且, 血清IgG4蛋白质浓度高于正常,通常都是在患慢性呼吸系统疾病（包括哮喘）的成人和儿童身上发现。68
跟检测IgE和IgG一样，两位点IMAs也已用于变应原特异性IgG4抗体的半定量测定。不同的是用标记的抗IgG4抗体做检测蛋白质。对检测出现的抗体滴度和表明血清标本中的抗体浓度，该方法很有用。IgG4异构型抗体在过敏性疾病中很重要，因为这些抗体可能与嗜碱性粒细胞结合，加入到促使致敏细胞释放组胺的行列当中。69它们除了作为可能的皮肤过敏抗体，临床研究还表明：在正常成人和哮喘成人身上，抗常见食物和吸入性变应原（如牛奶、蛋、链格孢属种）的IgG4抗体水平相同。67在哮喘儿童的血清里，抗该类变应原的IgG4抗体比非过敏儿童更普遍。但由于在非过敏儿童身上，也可检测到IgG4抗体，所以，IgG4抗体的出现，对确诊哮喘，并无多大用处。至于滴度测定是否有用，还需更多的研究来证明。作为可能的皮肤致敏抗体，IgG4可能起一个“阻塞”抗体的作用。虽然有此发现，但还没有临床研究表明，检测IgG4抗体对评价免疫治疗的过敏病人有用。70-73
急性过敏反应介质的检测
已有几种分析物被认为是目前或即将发生的急性过敏反应的生物暗示因子，特别是过敏性反应和风疹。最常用的分析物是组胺,N-甲基-4-咪唑乙酸（MIAA，一种组胺代谢物），11-β-前列腺素F2α(一种前列腺素代谢物)和胰酶70-77这些分析物都有共同的特征：由肥大细胞或嗜碱细胞或两者都包含或分泌。肥大细胞被激活后，这些生物因子在血液或尿液中可被检测到或浓度增高。每一种分析物的浓度都很低，但肥大细胞被激活后，在血液或尿液中都可检测到，不过，每种分析物出现和消失的时间都不同。检测可能受干扰，这些干扰限制了实验结果的临床用途。可分别用RIA和汽液色谱法来检测组胺和MIAA。肥大细胞被激活后，不久就会出现组胺，但在15-60min内，有可能检测不到组胺。许多实验室用酸化的24小时尿来测定组胺和MIAA，尿液中，两种分析物的排泄都与肌氨酸酐的浓度相关。尿液中组胺和MIAA的检测受组胺含量丰富的食物干扰，对尿道感染的病人，结果不可靠。尿液里11-β-前列腺素F2α的值还未最后确定，该分析物的诊断用途也未确定。胰酶是肥大细胞被激活的最有用的生物标记。胰酶是一个134，000Mr的中性蛋白酶，在肥大细胞分泌物的所有亚型中都发现有，而且，被释放后，它与肝磷脂或软骨素硫酸盐蛋白多糖结合。胰酶在肥大细胞被激活后30min –1h，在血液中就可达到可检测水平（>1U/L），并能持续存在12h。
细胞免疫实验室方法：淋巴细胞计数和功能评价
免疫反应在术语上是用来描述由淋巴细胞介导的宿主减少各种外来抗原的所有生物反应的总和。它有两部分组成：细胞免疫和体液免疫，即细胞毒素和T淋巴细胞介导的迟发性过敏反应及由B淋巴细胞介导的特异性抗体的合成和分泌。每一型反应都需要有能识别抗原或能激发效应细胞增殖的细胞之间的相互作用。如：由B淋巴细胞转化的浆细胞合成特异性的抗体，首先是单核巨噬系统的抗原提呈细胞开始，然后，巨噬细胞和T淋巴细胞共同作用，产生细胞因子，使B淋巴细胞分化，克隆并产生抗体。在评价免疫系统的整体功能，以及鉴别疾病状态中出现的缺陷或亢进机制时，很有必要对那些起不同功能的细胞进行计数并研究它们在体内的功能。
人类淋巴细胞计数和功能检测，在较长的一段时间里，只有少数具有分离淋巴细胞和检测亚群功能的试剂和技术的研究实验室做。近几年，随着商业的发展和能特异性抗不同功能的淋巴细胞亚群细胞表面糖蛋白的多克隆抗体的产生，这种情形开始发生改变。这些试剂已被广泛地提供，免疫功能的检测也不再神秘。下面几节，我们把用于临床实验室的淋巴细胞计数和淋巴细胞体内功能评价的基本方法，做一综述。
这些实验室方法的结果对异常免疫反应的分类很有用，但只有少数对单独的疾病的本质具有特异性。由于这些实验的诊断特异性有限，在临床上常规使用它们时更要注意。虽然临床调查的数据有限，实验结果在处理免疫系统受影响的特殊疾病的病人时，有用程度也还不清楚，但CD4+T淋巴细胞的计数已用于人类免疫缺陷病毒感染的个体分类中。
淋巴细胞亚群的计数
外周血中存在几种成熟的淋巴细胞亚群。78组成这些亚群的有：具多种不同功能的胸腺淋巴（T）细胞；合成和分泌特异性抗体，来源于淋巴结的（B）淋巴细胞；null细胞（也叫第三群细胞），它参与抗体介导的细胞毒作用及自然细胞毒作用（自然杀伤细胞）。这些亚群是根据结合在细胞膜上的一个或多个糖蛋白而定义的。根据簇设计和表达各种抗原的细胞类型，可以在附录的CD分子表中，找到这些糖蛋白的列表。这些糖蛋白许多都被认为对分子功能很重要。但在T淋巴细胞中，一个单独的细胞表面糖蛋白的出现并不能说明细胞的功能特征。79.80例如，有些带CD8标志的T淋巴细胞是细胞毒细胞，其它的却是抑制/效应细胞。带CD4标志的T淋巴细胞更异质：有些作为诱导细胞促进效应细胞克隆的扩大；有些作为辅助细胞，促进抗体分泌性B淋巴细胞的生长；还有其它的作为抑制/效应细胞或迟发性变态反应的效应因子。80-82
细胞膜表面糖蛋白很有用，因为它使识别和计数具有不同功能的淋巴细胞亚群成为可能。但目前有关T淋巴细胞表面糖蛋白的描述，通常都定义了实行不止一种功能的亚群。带有某一特定糖蛋白标志物的细胞数增加或减少，并不意味那些细胞在体内只实行某一特定功能。由于这个原因，淋巴细胞亚群的计数结果与疾病诊断或对治疗的反应有经验上的联系。而且，这些经验上的关联，在临床上很有用，正如表31-5的例子所证明的那样。
计数血液中淋巴细胞亚群的方法是以多克隆抗体的提供为基础的，这些多克隆抗体能识别单独的细胞表面糖蛋白。典型的操作是：将荧光标记的多克隆抗体与外周血一起孵育，然后在流式细胞仪中计数反应细胞。流式细胞仪是由一个或多个激光源、成像检测器和细胞束（该细胞束能直接通过激光光路）产生装置构成的细胞分析仪（图31-6）。用直角光散射，调节流式细胞仪，可根据淋巴细胞的大小识别淋巴细胞，合适抗体处理细胞后，用直接荧光计数带有特异细胞表面糖蛋白的淋巴细胞。通常用结合不同荧光的两种不同抗体同时计数带有特异性表面糖蛋白的淋巴细胞，该技术叫荧光分析法，它用处很大。当定义了更多的表面标志物的时候，就有可能鉴别和定量在体内仅实行某一单独功能的淋巴细胞亚群。83而且，体内刺激细胞后，通过检测细胞因子的合成，也能确定特异性的细胞亚群在功能上是否完整。使用能通透细胞的试剂，然后用相应的单克隆抗体染色，可检测好几种细胞因子（如肿瘤坏死因子，IL-2，γ干扰素）。84-87
淋巴细胞亚群的计数，也叫T或B细胞表面标志物的分析，由此得到不同类型的结果，见表31-6。每一种淋巴细胞亚群的百分数和绝对数，都应该与健康个体的结果做对比。另外，在典型的分析中，应报告一型与另一型（如辅佐/诱导，抑制/细胞毒细胞比率）的比率。
淋巴细胞体内功能测定
根据对体内细胞生长的激发不同，可以把淋巴细胞功能检测的方法大致分为两大类：抗原特异性和多克隆性。只有以前接触过抗原的个体的细胞，才能被激发出针对特异性抗原的阳性反应，但所有正常个体的细胞，都可被激发出多克隆活性因子的阳性反应。可用抗原，也可用多克隆活性物作激活物，阳性反应表明反应所需的细胞反应和细胞因子都以合适的比例出现。88
抗原特异性迟发性过敏反应，即针对记忆抗原的T淋巴细胞反应，可以通过下列方法常规检测。梯度离心，从外周血中获得单核细胞，将单核细胞与培养孔内不同浓度的检测抗原结合，该培养孔中含生长基质和固定量的细胞。在免疫的个体中，T淋巴细胞识别已被处理的抗原，经激活的巨噬细胞产物白细胞介素-1和T淋巴细胞分泌的生长因子白细胞介素-2的诱导，T淋巴细胞发生增殖。88在培养基中加入放射性核素标记的脱氧核糖核酸（DNA）（3H-胸腺嘧啶脱氧核苷）,就可以检测激活的T淋巴细胞的增殖。通过测定放射性核素与细胞内DNA的结合，可以确定增殖反应的量。与只含培养基不含抗原的培养孔的细胞相比，含抗原的培养孔中生长的细胞内DNA结合的3H-胸腺嘧啶脱氧核苷增加，表明反应呈阳性。不同的免疫个体，增殖反应的程度不同。增殖反应取决于好几个因素,包括体内接触抗原后，过去的时间，个体的年龄和抗原的化学特征。
某些常见抗原（如白色念珠菌和用于诱导特异性免疫的抗原，如破伤风毒素。）对评价个体产生迟发性过敏反应的整体功能是有用的。体内对这些抗原无反应，表明有T细胞参与的细胞介导的免疫缺陷。其他在环境中不常见的抗原，在评价免疫缺陷的作用或某些疾病状态时的特异性迟发过敏反应也有用。例如，已经发现在某些复发弥漫性组织胞浆菌病的病人体内缺乏对组织胞浆菌素抗原的迟发性过敏反应。已有人提到，该异常反映了宿主免疫反应已获缺陷，而宿主免疫反应在允许荚膜组织胞浆菌体内生长中起重要作用。
多克隆激活因子，也叫有丝分裂原，它通过结合细胞膜糖蛋白的碳氢部分，而诱导淋巴细胞的增殖。许多常用的多克隆激活因子取自植物提取物，被称为植物凝集素。不同的植物凝集素以不同的程度刺激不同的淋巴细胞亚群。临床实验室最常用的是刀豆球蛋白A（con A）和植物血细胞凝集素（PHA），它们都能很显著地刺激T淋巴细胞。还有美洲商陆有丝分裂原，在有巨噬细胞出现的情况下，它能刺激培养的T和B细胞。美洲商陆有丝分裂原也叫T细胞依赖性B细胞有丝分裂原。
如前所述，多克隆激活因子与外周血的单核细胞的结合，可评价T或B淋巴细胞的功能随培养基中有丝分裂原的浓度而发生改变，该培养基是含人类血清或胎儿腓肠血清的培养基。测定培养基中生长的细胞内DNA3H的结合情况，可以检测T淋巴细胞的增殖反应。与含人类血清培养基中生长的细胞相比，含ConA或PHA的培养基里生长的细胞内3H增高，表明为阳性反应。由于促有丝分裂原诱导了正常淋巴细胞的多克隆增殖，健康个体的阳性反应比记忆抗原的反应要大得多。
接触了美洲商陆有丝分裂原的B淋巴细胞的增殖和分化成Ig分泌细胞，需要有巨噬细胞和T淋巴细胞产生的细胞因子。检测含促有丝分裂原孔的上清液里的Ig浓度（IgM，IgG和IgA），可以定量检测B淋巴细胞对美洲商陆的反应。通过对比含美洲商陆培养基产生的Igs浓度与含胎儿腓肠血清的培养基中产生的Igs浓度，可检测反应的量。91与前面描述的测定方法的结果不同，它跟T淋巴细胞产生迟发性过敏反应的能力无关，经诱导产生的Ig是用来检测体液免疫的，它对定义那能相互调节以诱导合成和分泌Igs的B淋巴细胞、别的亚群及巨噬细胞的整体功能都很有用。先天性或获得性低丙种球蛋白血症的病人，体内缺乏对美洲商陆有丝分裂原的反应，也有可能是下列原因造成：丙种球蛋白质量异常；B淋巴细胞质量异常或播散性数量；缺乏巨噬细胞或辅佐细胞产生的作用于B淋巴细胞的生长因子；或者是由巨噬细胞或抑制性T淋巴细胞介导的过度抑制。91
淋巴细胞体内功能的检测，在临床上的应用很有限，因为检测需要好几天，花费较高且难标准化。结果虽然对确认某些临床诊断有用，但通常都不能指出在临床上处于怀疑阶段的新的诊断。更重要的是：由于提供给临床医生治疗常见的免疫紊乱的治疗替代物有限，实验室免疫测定的结果通常在决定某一特定治疗方案时，并不重要。虽然有这些限制，但淋巴细胞的体内功能检测得到的数据，对发展免疫疾病的分类几更好理解他们的家族史，对于客观地评价新治疗方法的有效性，都是很重要的。
