通过BSL-3实验室分选活的、传染性细胞

随着高速分选有活性的、传染性细胞和治疗性细胞样品需求的增加，保护流式细胞仪操作员的安全也相应显得尤为重要。通过 BSL-3 实验室确保分选活的、传染性细胞之前的样品密闭保护。这个程序包括气溶胶控制、物理屏障、环境控制和个人防护。气溶胶处理系统在分选室里面产生负压使气溶胶直接通过真空装置进入到高效粒子空气过滤器。物理屏障包括仪器制造厂的标准塑料防护罩和屏蔽面板。出于最大限度地考虑环境控制的原因，BSL-3 实验室的流式细胞仪，是通过一个呼吸保障系统来保护操作者。通过强荧光性的 Glo-Germ^TM 颗粒在同样的条件下，将分选器校正至产生大量的气溶胶后，进行分选来测定气容胶防护情况。分别在三个位置通过真空取样系统收集这些气溶胶 10 min 于载玻片上，然后用显微镜检测。通过这个系统，能够快速、有效地细胞分选检测气溶胶防护情况，减少操作员分选有活性的、传染性细胞时的危险。

通过 BSL-3 实验室分选活的、传染性细胞的基本原理是测定气溶胶防护情况可以采用强荧光微粒（Glo-Germ^TM），在紫外灯的照射下这些颗粒发出最强的荧光。建立一种高效率的程序来收集气溶胶并以此测量气溶胶，如果控制不佳而产生的包含 Glo-Germ^TM 颗粒的气溶胶的载玻片可在荧光显微镜下检出荧光颗粒。因此，控制的效率含量与每张载玻片上增加的微粒数目相关，可接受的偏差是在分选室的外面没有可检测到的颗粒。

器材：

（1）AeroTech 6^TM 活性的微生物微粒采样器（Aerotech Laboratories，Inc.，凤凰城，亚利桑那州 ［www.aerotechlabs.com］，目录号. 6^TM）。

（2）Matheson 流量计：真空计（Thomas Scientific，斯韦兹伯勒，新泽西州，目录号. 5083R60)。

（3）带有 HEPA 过滤系统的气溶胶处理系统（AMS）（BD Biosciences，圣何塞，加州）。

（4）Dupuy 生物危害呼吸系统（Chesapeake Surgical，Ltd.，斯特灵，费杰尼亚洲）：光伏头盔及电池，目录号. 5430-01-000；电池，目录号．5430-35-000；4 充电站，目录号. 5430-48-000；Hytrel 通用防护服，5430-32-000；齐膝高靴，目录号. 5409-55-000。

（5）带有分选功能的流式细胞分析仪（e.g. FACSDiVa，BD Biosciences）。

（6）荧光显微镜（如尼康显微图像分析系统，哥伦比亚，马里兰州）。

（7）层流柜（如 Baker 公司，桑福德，缅因州）。

试剂：

① Glo-Germ^TM 颗粒：5 ml 的乙醇中加入 5 μm 的三聚氰胺异分子聚合树脂珠。若 Glo-Germ 为粉剂，在使用之前溶解在 5 ml 的 100％ 乙醇中制成悬液；

② 100％ 乙醇；

③ PBS。

洗液：包含 10％ 胎牛血清（FCS）的 PBS，1％ Tween-20，1 mg/ml 叠氮钠。

通过 BSL-3 实验室分选活的、传染性细胞的基本过程可分为如下几步：

1 气溶胶控制系统（AMS）

在高压的条件下分选活性的、感染性物质（传染性细胞），必须遵循以下的指导原则和操作程序，以确保气溶胶得到很好的控制。

1.1 AMS 系统的建立和使用必须按照制造商的说明书进行。

1.2 真空装置监视器的允许范围须在 1.5~2 英时水柱。如果不在此范围之内，更换 HEPA 过滤器和管道。高压灭菌替换的 HEPA 过滤器和管道。

1.3 过滤器的使用寿命的范围指示必须高于 40％。如果低于 40％，就更换 HEPA 过滤器和管道。高压灭菌替换的 HEPA 过滤器和管道。

1.4 FACSDiVa 上的 Accudrop 系统是用来决定液滴延迟的，必须按照制造商的说明书来正常操作。此外，照相系统用来监视分选气流和提醒操作员可能会出现的潜在增加的气溶胶。如果出现气溶胶的增加，操作员应该立即纠正分选气流，以减少气溶胶的污染。

2 气溶胶允许范围和防护的测量

当细胞分选时，AMS 必须在相似的分选条件下进行测试，在分选活的、传染性物质之前，AMS 运行的相关指标必须在允许范围内以确保 AMS 正常的功能。然而，为了提供最大可能性来测量气溶胶防护情况，分选器可设置在本节描述的「故障模式」下进行检测。

2.1 把一张洁净的载玻片放入到一个干净的有盖培养皿中，然后放入到 AeroTech6^TM 有活性的微生物粒子采样器中。盖上顶盖并且仔细地把每边的卡环都扭紧。这个装置一直保持在层流框下面直到气溶胶防护检测结束。

2.2 把一块洁净的载玻片放入到位于自动臂的顶部的分选室内，这个载玻片用作阳性对照。

2.3 调节 AeroTech6^TM 微生物粒子采样器的真空度 45 L/min（通过 Matheson 流量计测量）。

2.4 检查所有的气溶胶真空的联连，然后把 AMS 真空的开关打开。用英寸水柱记录真空压力在表 1 中。

2.5 在 25 磅/平方英寸（psi）的条件下调节 Glo-Germ 微粒流速至 20 000 个粒子/秒。

2.6 关闭门和偏转板，调节废物收集器的流量以产生尽可能大的气溶胶。这种状况被称为操作的「故障模式」。

2.7 按照说明书关闭所有的防护屏障。

2.8 移动 Aero Tech 6^TM 活性微生物微粒采样器到 3 个位置，每个位置放 10 min。推荐直接放在分选室门前或者分选室顶部，距离分选室前 2 英尺远位置（通常在操作员的椅子上）。

2.9 停止分选；从 Aero Tech 6^TM 活性的微生物微粒采样器上以及分选室内部分别取出样品和阳性对照的载玻片。防止样品管反滴。为了去除样品管中过多的微粒，加 70％ 浓度的乙醇于采样器中，在分选的条件下运行 5 min。

2.10 用 10 倍物镜的荧光显微镜及异硫氰酸荧光素放射光滤光片（520~640 nm）扫描检查整张玻片。两张载玻片都检查。

2.11 记录结果于表 24-1。在开始活的传染性分选细胞之前，所有的允许范围测定必须完成。结果若有任何偏差，重复操作。

2.12 分选室外的微粒允许范围：0 许可，整张玻片上没有微粒。任何阳性的结果必须检查解决，在传染性分选之前需重新检测。

2.13 分选室里的微粒允许范围（阳性对照）：每个视野高于 50（10 倍物镜，结果随载玻片的位置而有所不同）。

3 个人安全设施（基本屏蔽）：Dupuy HEPA 过滤防护服和呼吸系统

此系统用于任何潜在的传染性分选操作之前，因为传染性的气溶胶在分选的过程中均有可能形成。

3.1 连接电池到防护头盔；打开开关确定防护头盔的风扇处于正常的状态下，然后关闭。

3.2 穿上防护靴

3.3 从无菌的塑料袋里取出 Hytrel 通用防护服，在防护罩的前面用粘扣带把防护罩系在面罩上面。

3.4 确认在 Hytrel 通用防护服上的 HEPA 过滤器位于头盔动力扇的上面。

3.5 调整好 Hytrel 通用防护服、头盔以及衣袖使其更合身。电池包应该系在衣服里面的皮带上。如果正确操作，气流会使外套膨起。

3.6 戴上双层手套，加戴护袖。通过 HEPA 过滤器，在头盔的顶部过滤空气流，并且从防护服的底部流出。在进入 BSL-3 实验室之前应该做最后的调整。