（交流）免疫凝集试验方法-间接凝集反应
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间接凝集反应
l 间接血凝反应
致敏红细胞的制备：
直接法：
1．取10%双醛固定的红细胞悬液1ml，离心沉淀后，将压积细胞悬于0.1mol/L、pH4.0醋酸缓冲液5ml中。
2．预温后加含适量致敏抗体的醋酸缓冲液5ml，混匀，放37℃20~30min或24℃ 60~75min，其间摇动数次，但不宜剧烈和频繁摇动，以免引起自凝。
3．最后用0.11mol、pH7.2 PB洗3次。
4．洗涤后的致敏红细胞用保存液配成10%悬液4℃保存或冻干。临用前，用实验中所用血清稀释液配成0.5%浓度。
间接法1：鞣酸法
1．取压积红细胞0.5ml，加0.15mol/L pH7.2 PB至100ml，加入0.05g/L鞣酸液100ml，混匀，放置37℃ 10min。
2．离心沉淀后，用同一缓冲液洗3次，重悬于生理盐水100ml中。加等量含适量抗原（或抗体）的同一缓冲液，置室温致敏10min。
3．离心沉淀用1：250稀释的正常家兔血清洗涤后，制成0.5%的致敏红细胞悬液。
间接法2：戊二醛一步法
1．将绵羊或人“O”型红细胞用0.11mol/L pH7.2 PB洗3次，取沉积红细胞0.1ml，加至含0.1mg抗原或抗体的PB（用于抗原）或pH4.0醋酸缓冲液（用于抗体）2ml中，电磁搅拌下缓慢滴加2.5%戊二醛0.25ml。
2．继续于室温搅拌2h后，用PB洗3次，然后用稀释液20ml配成0.5%致敏红细胞悬液。
间接法3：戊二醛二步法
1．将绵羊红细胞用0.11mol/L pH7.2 PB洗5次，用1%戊二醛配成2%悬液，于4℃醛化30min。
2．醛化完毕，用PB洗5次，用pH4.0醋酸缓冲液（或pH7.2 PB）配成5%悬液。取此悬液10份，加入6份用pH7.2 PB配制的抗原溶液（抗原浓度预测定）或用pH4.0醋酸缓冲液配制的抗体溶液（IgG约200μg/ml）。
3．37℃水浴1h，时时摇动，取出后用PB洗2次，用稀释液配成0.5~1%悬液。醛化红细胞如不立即致敏，4℃可保存2个半月，致敏红细胞可保存3个月。
间接法4：CrCl3法
1．取洗过5次的2%红细胞悬液10ml，加入0.2ml抗原（或抗体）溶液，混合后在电磁搅拌下缓慢滴入最适浓度的CrCl3溶液，置室温5min，其间摇动1~2次。
2．加入等体积PB中止反应，用PB洗2次后配成0.5%~0.75%细胞悬液。
间接法5：双偶氮联苯胺（BDB）法
1．取含适量抗原或抗体的0.15mol/L pH7.2 PB 3ml，加50%醛化固定的红细胞0.1ml，混匀。
2．加BDB应用液1ml，混匀放室温15min，4℃离心，用PB洗2次，用含1%兔血清的生理盐水配成1%红细胞悬液。
间接血凝试验
1．用球形玻璃滴管吸取稀释液，在微量血凝板小孔内加1滴稀释液。每份标本做二排，一排为测定孔，另一排为对照孔，每排至少6孔。
2．用稀释棒2支蘸取受检血清后，分别放入测定排和对照排的第1孔，双手搓转稀释棒（20次左右），使孔内血清与稀释液充分混匀。然后将稀释棒移至第二孔，按同法依次作倍比稀释至第6孔。
3．测定排各孔加稀释液1滴，对照排各孔加抑制用抗原1滴，置微型振荡器上振荡1~2min，盖上玻璃板，放37℃保温1h。
4．各孔加0.5%抗原致敏红细胞悬液1滴，置微型振荡器上振荡1min，移放室温1~2h。
间接血凝抑制试验
1．稀释抗体法：将检测抗体的待测标本做递倍稀释后，各加定量抑制用的已知标准抗原，放37℃2h，使之充分结合。然后加入抗原致敏的红细胞悬液，再放37℃2h。同时做一排不含抗原的血凝试验对照。
2．稀释抗原法：将检测抗原的受检标本做倍比稀释后，加入足以使抗原致敏红细胞发生凝集的相应抗血清。放37℃水浴2h，使之充分结合。加入0.5%抗原致敏红细胞悬液，再放37℃水浴2h观察结果。
l 胶乳凝集试验
致敏胶乳试剂的制备（物理吸附法）
1．先用蒸馏水将10%胶乳悬液稀释至1~2%。继将吸附物（抗原或抗体）溶于pH8.2硼酸缓冲盐水或pH8.2甘氨酸缓冲盐水中，逐滴加入稀释的胶乳悬液中，摇动使之充分混匀。1%胶乳悬液1ml，一般能吸附0.1~1mg物质。
2．放置室温或37℃ 30~60min。
3．吸附完后，4000r/min离心30~45min，弃去上清液，沉淀仍用同一缓冲盐水恢复悬浮状态。
胶乳凝集试验方法
1．胶乳凝集试验：先加受检标本，滴于反应板上，再加致敏胶乳1滴，连续摇动2~3min后观察结果。胶乳凝集者为阳性，不凝集者为阴性。同时需做阴、阳性对照。
2．胶乳凝集抑制试验：在反应板上先加受检标本1滴，再加1滴配对抗血清混匀，最后加1滴致敏胶乳悬液，连续摇动2~3min观察结果。胶乳凝集者为阴性，不凝集者为阳性。同时需做阴、阳性对照。
l 明胶凝集试验
1．每份标本需3个平行孔，于3个孔内分别加入血清稀释液75、25、25μl。
2．取待检测血清25μl加入第1孔内，然后倍比稀释至第2、3孔内，此时标本的稀释倍数为1：4、1：8、1：16，同时设阳性对照。
3．第2孔内加25μl未致敏颗粒悬液（阴性对照），第3孔内加25μl致敏颗粒悬液，将反应板置微量振荡器上，充分混匀1min，盖上盖子于室温2h后观察结果。
l 间接血凝反应
致敏红细胞的制备：
直接法：
1．取10%双醛固定的红细胞悬液1ml，离心沉淀后，将压积细胞悬于0.1mol/L、pH4.0醋酸缓冲液5ml中。
2．预温后加含适量致敏抗体的醋酸缓冲液5ml，混匀，放37℃20~30min或24℃ 60~75min，其间摇动数次，但不宜剧烈和频繁摇动，以免引起自凝。
3．最后用0.11mol、pH7.2 PB洗3次。
4．洗涤后的致敏红细胞用保存液配成10%悬液4℃保存或冻干。临用前，用实验中所用血清稀释液配成0.5%浓度。
间接法1：鞣酸法
1．取压积红细胞0.5ml，加0.15mol/L pH7.2 PB至100ml，加入0.05g/L鞣酸液100ml，混匀，放置37℃ 10min。
2．离心沉淀后，用同一缓冲液洗3次，重悬于生理盐水100ml中。加等量含适量抗原（或抗体）的同一缓冲液，置室温致敏10min。
3．离心沉淀用1：250稀释的正常家兔血清洗涤后，制成0.5%的致敏红细胞悬液。
间接法2：戊二醛一步法
1．将绵羊或人“O”型红细胞用0.11mol/L pH7.2 PB洗3次，取沉积红细胞0.1ml，加至含0.1mg抗原或抗体的PB（用于抗原）或pH4.0醋酸缓冲液（用于抗体）2ml中，电磁搅拌下缓慢滴加2.5%戊二醛0.25ml。
2．继续于室温搅拌2h后，用PB洗3次，然后用稀释液20ml配成0.5%致敏红细胞悬液。
间接法3：戊二醛二步法
1．将绵羊红细胞用0.11mol/L pH7.2 PB洗5次，用1%戊二醛配成2%悬液，于4℃醛化30min。
2．醛化完毕，用PB洗5次，用pH4.0醋酸缓冲液（或pH7.2 PB）配成5%悬液。取此悬液10份，加入6份用pH7.2 PB配制的抗原溶液（抗原浓度预测定）或用pH4.0醋酸缓冲液配制的抗体溶液（IgG约200μg/ml）。
3．37℃水浴1h，时时摇动，取出后用PB洗2次，用稀释液配成0.5~1%悬液。醛化红细胞如不立即致敏，4℃可保存2个半月，致敏红细胞可保存3个月。
间接法4：CrCl3法
1．取洗过5次的2%红细胞悬液10ml，加入0.2ml抗原（或抗体）溶液，混合后在电磁搅拌下缓慢滴入最适浓度的CrCl3溶液，置室温5min，其间摇动1~2次。
2．加入等体积PB中止反应，用PB洗2次后配成0.5%~0.75%细胞悬液。
间接法5：双偶氮联苯胺（BDB）法
1．取含适量抗原或抗体的0.15mol/L pH7.2 PB 3ml，加50%醛化固定的红细胞0.1ml，混匀。
2．加BDB应用液1ml，混匀放室温15min，4℃离心，用PB洗2次，用含1%兔血清的生理盐水配成1%红细胞悬液。
间接血凝试验
1．用球形玻璃滴管吸取稀释液，在微量血凝板小孔内加1滴稀释液。每份标本做二排，一排为测定孔，另一排为对照孔，每排至少6孔。
2．用稀释棒2支蘸取受检血清后，分别放入测定排和对照排的第1孔，双手搓转稀释棒（20次左右），使孔内血清与稀释液充分混匀。然后将稀释棒移至第二孔，按同法依次作倍比稀释至第6孔。
3．测定排各孔加稀释液1滴，对照排各孔加抑制用抗原1滴，置微型振荡器上振荡1~2min，盖上玻璃板，放37℃保温1h。
4．各孔加0.5%抗原致敏红细胞悬液1滴，置微型振荡器上振荡1min，移放室温1~2h。
间接血凝抑制试验
1．稀释抗体法：将检测抗体的待测标本做递倍稀释后，各加定量抑制用的已知标准抗原，放37℃2h，使之充分结合。然后加入抗原致敏的红细胞悬液，再放37℃2h。同时做一排不含抗原的血凝试验对照。
2．稀释抗原法：将检测抗原的受检标本做倍比稀释后，加入足以使抗原致敏红细胞发生凝集的相应抗血清。放37℃水浴2h，使之充分结合。加入0.5%抗原致敏红细胞悬液，再放37℃水浴2h观察结果。
l 胶乳凝集试验
致敏胶乳试剂的制备（物理吸附法）
1．先用蒸馏水将10%胶乳悬液稀释至1~2%。继将吸附物（抗原或抗体）溶于pH8.2硼酸缓冲盐水或pH8.2甘氨酸缓冲盐水中，逐滴加入稀释的胶乳悬液中，摇动使之充分混匀。1%胶乳悬液1ml，一般能吸附0.1~1mg物质。
2．放置室温或37℃ 30~60min。
3．吸附完后，4000r/min离心30~45min，弃去上清液，沉淀仍用同一缓冲盐水恢复悬浮状态。
胶乳凝集试验方法
1．胶乳凝集试验：先加受检标本，滴于反应板上，再加致敏胶乳1滴，连续摇动2~3min后观察结果。胶乳凝集者为阳性，不凝集者为阴性。同时需做阴、阳性对照。
2．胶乳凝集抑制试验：在反应板上先加受检标本1滴，再加1滴配对抗血清混匀，最后加1滴致敏胶乳悬液，连续摇动2~3min观察结果。胶乳凝集者为阴性，不凝集者为阳性。同时需做阴、阳性对照。
l 明胶凝集试验
1．每份标本需3个平行孔，于3个孔内分别加入血清稀释液75、25、25μl。
2．取待检测血清25μl加入第1孔内，然后倍比稀释至第2、3孔内，此时标本的稀释倍数为1：4、1：8、1：16，同时设阳性对照。
3．第2孔内加25μl未致敏颗粒悬液（阴性对照），第3孔内加25μl致敏颗粒悬液，将反应板置微量振荡器上，充分混匀1min，盖上盖子于室温2h后观察结果。
