【共享】肿瘤化疗与免疫系统改变

丁香园2015-06-29

1987

本文来自免疫学社区www.immunechina.cn
1909年，Paul提出了免疫系统控制癌症发生的假说；50年后，Burnet等进一步强化了肿瘤免疫监控的概念；2007年12月，Koebel等提出，对肿瘤细胞的清除需要主动免疫和被动免疫，而使肿瘤细胞隐匿仅需要被动免疫，而且免疫系统可以定时和定量的监控癌症的发展。临床上也发现，免疫抑制的患者中，部分实体瘤高发；相反，也有肿瘤自发性消退的报告。因此为了赢得对癌症的战争，不仅必需发展可以有效杀灭癌症（干）细胞的策略，也需要上调免疫系统，使隐匿的肿瘤细胞受到控制。

由于历史原因，癌症药物开发计划很少关注免疫反应可能影响药物治疗的有效性，如1976年来，美国NCI的药物筛选和确认方法即是将肿瘤细胞移植到免疫缺陷小鼠。然而，越来越多的证据显示，细胞毒药物或放射线以2种方式诱导免疫系统。一种是直接诱导特异的细胞免疫反应，导致肿瘤细胞死亡；其次是诱导短暂的淋巴细胞削减（lymphoablation），然后刺激免疫效应分子产生，解除受抑制的免疫反应。此外，针对癌症特异性抗原的疫苗也能够增加肿瘤对化疗药物的敏感性。

因此，避免将癌症免疫学与癌症遗传（细胞生物学）和癌症化疗分割对待，将为患者提供最优的治疗方法。

1 化疗对免疫系统的抑制性（antagonistic）影响

目前很多治疗方法均能够减弱抗肿瘤免疫反应。如为消除局部转移而切除肿瘤引流的淋巴结——T细胞启动的最优微环境。而更重要的是，一些细胞毒药物直接或间接杀死免疫效应细胞，导致免疫系统功能低下或免疫无能。

1.1 化疗药物的免疫抑制效应

目前癌症化疗中的几个药物被当作免疫抑制以治疗系统性自身免疫疾病。CTX和MTX主要损害外周T细胞的增殖和(或)效应功能。酪氨酸激酶抑制剂（高剂量imatinib，格列卫）也会抑制T细胞的增殖和激活。格列卫也会抑制同源移植的移植物抗白血病反应，增加患者病毒和细菌感染的可能性。

由于糖皮质激素可以启动淋巴细胞凋亡，因此是治疗多种淋巴系统肿瘤的重要药物，也用于减轻癌症化疗中的恶心和呕吐。糖皮质激素抑制由单核细胞产生的前炎症因子（INFα，β），趋化因子（CXCL8）的产生，也明显抑制树突状细胞（DC）的分化和抗原递呈。而且，糖皮质激素也会抑制获得性免疫反应相关的基因（MHCⅡ类抗原、T细胞受体基因）的表达，降低T细胞的功能，抑制TH1细胞的发育，因此阻止效应分子和记忆性抗肿瘤免疫的启动。糖皮质激素可以上调TGFβ家族的几个分子，增加对T细胞和NK细胞的效应分子的抑制；抑制NK细胞增殖和NK细胞毒受体（NKp30和NKp44）的表达，减弱NK细胞的细胞毒反应。

1.2 化疗药物诱导的免疫耐受——凋亡

细胞毒药物诱导的细胞死亡绝大多数通过凋亡途径。传统的免疫学教科书均认为凋亡是一种生理性的、程序性的、不会导致细胞出现免疫原性的死亡，即一种非免疫原或免疫耐受性死亡，与坏死——病理性的，由免疫系统参与的细胞死亡明显不同。而免疫耐受是恶性细胞逃避免疫监控的重要原因。当注射丝裂霉素C时，会导致典型的癌细胞凋亡，但不会诱导免疫反应[4]。同样，20多个药物（蛋白酪氨酸激酶抑制剂、蛋白体抑制剂或DNA损伤药物）诱导凋亡是通过线粒体、溶酶体或内质网应激，导致癌症细胞死亡无免疫原性。凋亡的非免疫原性特征是由于细胞死亡出现磷脂酰丝氨酸的暴露——一个自噬信号，启动巨噬细胞吞噬作用，并刺激抗炎细胞因子的产生；而且，标准的凋亡程序也与免疫刺激信号的缺乏相关。当然，近2年的研究发现，抗癌药物也会触发细胞免疫原性死亡，如吉西他滨调节抗原特异性抗肿瘤免疫反应。

1.3 大量肿瘤抗原释放导致的免疫抑制

化疗导致大量肿瘤细胞突然死亡，对肿瘤特异性免疫反应会造成严重的后果。肢体部位局部晚期黑色素瘤使用隔离肢体注射（ILP）TNF和米法兰治疗，反应率高达80%，但不会延长患者的生存时间。值得注意的是，尽管存在明显的细胞死亡，但患者不会出现抗肿瘤免疫反应。

理论上，由ILP治疗后释放大量肿瘤抗原，可以损害计数反应效应T细胞。而且外周抗原数目与抗原特异的CD8+T细胞的免疫耐受之间存在直接的联系[5]。

因此，化疗药物可通过3种方式——本身性质（如烷化剂和糖皮质激素）、作用模式（如肿瘤细胞的死亡出现在细胞应激之前）或剂量/给药方式对免疫系统进行损害。

2 化疗与免疫系统的相互影响

2.1 DNA损伤的免疫反应

DNA损伤药物（离子放射线和拓扑异构酶抑制剂）可以刺激复杂的免疫反应，激活肿瘤抑制蛋白（蛋白激酶ATM）、CHK1和p53。通过ATM和CHK1，DNA损伤诱导肿瘤细胞表达NKG2D的配体，激活NK细胞、NKT细胞、γβT细胞和CD8+T细胞的肿瘤免疫监测。

同样，p53诱导的肿瘤细胞静止和免疫系统之间存在协同关系。在肝癌中，p53功能的恢复可以导致肿瘤消退，但仅仅当小鼠NK细胞、中性粒细胞和巨噬细胞功能正常时。原因是p53的重新激活可以诱导前炎症因子（如IL-15和M-CSF）、粘附分子和细胞趋化因子的表达，促进NK细胞、中性粒细胞和巨噬细胞向肿瘤聚集。总之，DNA损伤激活ATM、CHK1和p53，促使静默的免疫系统向抗肿瘤反应进行转变。

2.2 高剂量烷化剂与淋巴细胞削减

在癌症的被动免疫和疫苗治疗中，治疗诱导的淋巴细胞减少受到高度关注。短暂的淋巴细胞减少激活肿瘤效应T细胞，并解除肿瘤诱导的免疫抑制，增加治疗效果。诱导淋巴细胞减少的常用方法有低剂量全身放疗和高CTX单独或与氟达拉滨联合。淋巴细胞减少也会增加T细胞向肿瘤聚集，以及肿瘤内效应细胞的增殖。全身放疗还会导致粘膜屏障的损伤，促进微生物侵入体内并释放TLR4的配体（脂多糖，LPS），增加树突状细胞（DC）和T细胞的活性。动物研究发现，淋巴细胞减少可以增加肿瘤特异性CD8+T细胞的活性，此方法已经成功用于临床35例晚期对传统治疗耐药的黑色素瘤患者。

淋巴细胞削减也可以与疫苗治疗联合，促进记忆T细胞（可以识别自身肿瘤抗原）的分化。而且，致死性骨髓抑制后的自体骨髓干细胞移植可以增强被动免疫的抗肿瘤效果。

因此，化疗或放疗诱导的淋巴细胞减少联合其他的治疗方法（被动免疫治疗、疫苗或自体骨髓干细胞移植）是产生抗肿瘤免疫反应的有效方法。

2.3 低剂量CTX抑制调节性T细胞

虽然高剂量CTX通过淋巴细胞削减，杀死肿瘤细胞和解除免疫抑制，但低剂量CTX也具有调节免疫系统的作用。低剂量CTX通过下调抑制性T细胞亚群，加强延迟型超敏（DTH）反应。低剂量CTX还减少CD4+CD25+阳性的抑制性T细胞的数目，降低其抑制功能。CTX不仅减少抑制性T细胞、刺激INF?α的产生，增加抗体反应和维持记忆T细胞的功能，还与特异的免疫治疗进行协同，参与对肿瘤细胞的免疫性根除。

在小样本临床研究中，低剂量CTX与疫苗联合可以增加DTH反应，减少抑制性CD45+ T细胞的数目，延长转移性癌症患者的生存时间。每天按时口服CTX治疗终末期的癌症患者1个月，能够抑制抑制性T细胞的功能，恢复效应T细胞的增殖和NK细胞的细胞毒作用。然而，在癌症患者中，CTX免疫刺激作用的最优给药时间还需要研究。

2.4 蒽环类药物的免疫调节作用

对阿霉素的免疫调节作用已研究了几十年，阿霉素可以增强肿瘤疫苗的抗肿瘤效果。在免疫活性小鼠（具有同源的L1210小鼠细胞）身上通过IL-2与各种化疗药物联合（如DDP，CTX，紫杉醇或阿霉素）实验发现仅与阿霉素联合才能延长白血病小鼠的生存时间。若对小鼠先进行放疗或注射硅酸，IL-2+阿霉素的治疗作用则消失，提示放射线敏感的免疫效应细胞（可能是T细胞）和巨噬细胞是增加疗效所必需的。阿霉素增加免疫调节的抗肿瘤效果的机制可能是诱导免疫原性细胞死亡。

2.5 紫杉烷类对TLR4配体的调节

紫杉烷（紫杉醇和多烯紫杉醇）可以与微管蛋白的β亚单位结合，影响微管的聚合，导致细胞死亡。紫杉醇与小鼠TLR4结合，通过激活小鼠巨噬细胞和DC来模拟细菌LPS作用。在表达人类HER?2的小鼠中，使用紫杉醇可以增加肿瘤细胞疫苗的治疗效果。同样，紫杉醇治疗转染乳腺癌小鼠时，能增加肿瘤内接种DC的疗效。在3LL肿瘤模型小鼠中，使用多烯紫杉醇处理，随后放射线照射，与化疗单独使用相比，可以明显导致肿瘤消退。如果在肿瘤疫苗后使用多烯紫杉醇，则会消除疫苗的抗肿瘤效果。治疗后生存的小鼠存在针对3LL的特异记忆T细胞，而且对再次3LL肿瘤细胞的感染存在抵抗。在人类中，同样也有紫杉烷激活抗肿瘤免疫反应的证据。与不使用紫杉烷的患者相比，Ⅱ/Ⅲ期的乳腺癌患者使用紫杉烷治疗可以增强T细胞和NK细胞的功能。因此，人类和小鼠中得到的实验数据违背了传统的观念——紫杉烷抑制免疫细胞的功能。

2.6 吉西他滨的免疫刺激作用

吉西他滨是人工合成的嘧啶核苷类似物，其代谢物可以抑制核酸还原酶和DNA聚合酶-α，阻止DNA的合成。吉西他滨抑制B细胞（产生针对肿瘤抗原的抗体）的增殖，导致抗肿瘤免疫朝有益的T细胞反应偏斜。而且，吉西他滨减少骨髓抑制性T细胞的数目，还可增加DC依赖的肿瘤抗原向T细胞交叉递呈，诱导肿瘤细胞的凋亡。吉西他滨与CD40刺激的T细胞协同治愈小鼠的肿瘤。吉西他滨的免疫刺激作用在患者中已得到确认，在胰腺癌、非小细胞肺癌和结肠癌，吉西他滨联合重组细胞因子或疫苗能增加肿瘤特异的CTL细胞的数目，产生治疗反应。

2.7 5-Fu

5-Fu体外可诱导肿瘤细胞的HSP表达，促进抗原摄取和肿瘤抗原交叉递呈。人类结肠癌细胞系使用5-Fu处理后可以增加CD95和ICAM1的表达，而且对CTL导致的细胞溶解更敏感。在小鼠模型中，含5-Fu方案化疗后，DC肿瘤内的给药可以诱导T细胞依赖的肿瘤治疗部位的根除，而且重要的是，也发生于肿瘤转移部位，导致小鼠的长期生存。此效应的获得仅是DC与5-Fu联合治疗后，而不是单独治疗。在另一个模型中，5-Fu也能增加多肽基础的疫苗（直接对抗胸嘧啶的合成，其自身的分子靶点）的免疫效应。针对转移性结肠癌患者的大样本的随机临床实验正在进行。

2.8 地西他滨（Decitabine，DAC）

DNA甲基转移酶抑制剂DAC通常用于治疗白血病和骨髓增生异常综合征。DAC治疗可以恢复MHC1类抗原分子和肿瘤细胞上睾丸癌抗原的表达，导致肿瘤细胞对CTL打击敏感性增加。而且，编码死亡相关激酶蛋白的肿瘤抑制基因的高甲基化能在DAC治疗白血病的过程被抑制，因此恢复INFγ调节的凋亡细胞死亡通路。细胞因子诱导 INFγ的分泌，因此与DAC存在协同作用。联合IL?12与DAC在小鼠中可以抗白血病和黑色素瘤细胞。

2.9 Imatinib的免疫刺激作用

Imatinib可以直接作用于受体酪氨酸激酶突变部位，但很多患者不存在突变也对Imatinib有反应，原因可能是与NK细胞激活有关。虽然癌细胞在体外对Imatinib无反应，但小鼠体内，Imatinib可以调节NK细胞依赖的抗肿瘤效应。在宿主体内，Imatinib启动DC调节的NK细胞激活，以及NK细胞倚赖的抗肿瘤作用。在GIST患者中，Imatinib诱导的NK细胞IFNγ分泌是患者预后好的参数，提示人类NK细胞也参与Imatinib的治疗效果的发挥。

小鼠中，IL-2与Imatinib联合会增加肿瘤渗透效应细胞——IFN分泌的杀伤DC细胞（IKDC，因为具有骨髓DC细胞和NK细胞的表型和功能，产生IFNγ），能够溶解各种靶细胞，不管是否表达MHC1类分子或NKG2D配体。IKDC也能上调MHCⅡ类分子的表达，并产生大量的IFNγ。在免疫缺陷小鼠，IKDC细胞可以明显阻止肿瘤的进展。总之，Imatinib的抗肿瘤作用部分是通过刺激和增加IKDC来达到的。

3 放疗的远位效应

放疗对肿瘤细胞不仅具有直接细胞毒作用，还对组织和细胞进行其他调节，如刺激免疫反应。低剂量的离子放射线上调肿瘤细胞上MHC1类分子、肿瘤相关抗原和CD95的表达，以及由树突状细胞分泌的粘附分子，因此促进CTL的激活和T细胞向肿瘤放疗部位的聚集。单个肿瘤的局部放疗可以减少非放疗部位远处转移灶的体积——放疗的远位效应（abscopal effect），由免疫系统调节。Reits等发现，放射线通过调节肿瘤源性多肽向免疫系统的递呈，以3种方式增加肿瘤细胞的抗原性。首先，放疗增加已存在蛋白的分解，因此增加细胞内MHC1类递呈多肽的浓度。其次，在放疗的肿瘤细胞中，mTOR激活后刺激蛋白翻译和多肽的产生。最后，放疗刺激新蛋白即抗原性多肽的合成，然后递呈到具有识别功能的不同T细胞群。

4 化疗对T细胞调节免疫的影响

细胞毒药物的免疫系统影响依赖向淋巴T细胞递呈抗原的能力。此外，应激化疗肿瘤细胞可以上调NK细胞的刺激性配体或死亡受体，增加其对外源性免疫因子的敏感性。

4.1 伴侣分子（Chaperones）

细胞对应激（细胞毒药物）常见反应是激活大量伴侣分子（HSP）的翻译。HSP通过重新折叠受损的蛋白来阻止细胞死亡，或者促进受损的蛋白经蛋白酶降解，或在线立体前和后水平抑制凋亡。HSP也通过多个途径刺激免疫系统。

首先，HSP70和HSP90（如钙结合蛋白calreticulin）能作用于DC细胞表面的清道夫受体CD91，诱导DC成熟。HSP还可结合肿瘤特异抗原，然后经过MHCⅠ、Ⅱ通路，递呈到T细胞。纯化的多肽-HSP复合物能诱导对抗肿瘤性免疫。而且，来源于HSP疫苗的研究也取得了令人鼓舞的结果。

其次，伴侣分子在自食信号的DC激活中也具有重要作用。例如，使用蛋白体抑制剂硼替佐米治疗后，人类黑色素瘤细胞表面出现了HSP90，然后作为一个激活信号作用于同源DC。值得注意的是，此HSP90暴露依赖细胞毒药物硼替佐米但γ射线或类固醇处理后则不会发生。

第三，伴侣分子也出现于死亡细胞的表面，向巨噬细胞发出自食信号。当肿瘤细胞使用蒽环类药物几小时后，然后注射到小鼠皮下，可以高度有效地诱导特异DC和抗肿瘤的T细胞反应。因此，诱导外calreticulin（Ecto-calreticulin）的蒽环药物和离子放射线导致的是免疫原性细胞死亡，而其他药物（如丝裂霉素C和Vp16）不诱导外?calreticulin，也不会导致免疫原性死亡。通过特异的siRNA破坏诱导calreticulin的表达会消除由蒽环药物导致的细胞死亡的免疫原性。外原性补充calreticulin或使用促进calreticulin转移的药物（PPI磷酸酶抑制剂）能增加细胞死亡的免疫原性，也能增加丝列霉素C和Vp16的治疗效果。

4.2 TLR4和HMGB1

以蒽环药物，放射线和奥沙利铂为基础的治疗对正常免疫小鼠比无胸腺小鼠更有效，提示完整的免疫系统可以增加传统抗癌药物的疗效。

TLR4 （Toll-like receptor 4）及其下游效应分子MyD88的缺陷会降低化疗和放疗的效果，LR4缺陷的DC不能从死亡细胞递呈抗原。而且只有TLR4-MyD88通路功能正常时，死亡肿瘤细胞的抗原才能被DC交叉递呈到宿主的T细胞，并促进肿瘤特异的CTL分化。使用氯喹（趋溶酶体药物）或bafilomycinA1（空泡的ATP酶的第一个有效的特异性抑制剂），TLR4缺陷的DC导致的抗原递呈可以被恢复。此外，氯喹可以逆转TLR4缺陷在治疗中的副作用。

由死亡肿瘤细胞产生的TLR4配体是HMGB1（high-mobility group box 1 protein）在凋亡晚期释放的一种核蛋白。体内和体外研究发现，使用siRNA或特异的抗体中和消耗死亡细胞的HMGB1，则可以阻碍TLR4倚赖的DC调节的抗原递呈。所以，HMGB1的释放通过影响TLR4，是死亡细胞免疫原性所必需的。然而，HMGB1和calreticulin（不是两者联合）均不能促进DC的成熟，提示存在其他由死亡细胞释放的免疫刺激分子。

TLR4的多态性可导致TLR4 细胞外区域氨基酸的替换（Asp299Gly），减少HMGB1与TLR4的结合。因此，携带TLR4Asp299Gly等位基因的DC，将来源于黑色素瘤的交叉抗原递呈给CTL的能力远低于正常等位基因的患者，但可以被氯喹矫正。对280例存在局部淋巴结转移的患者回顾性分析发现，使用标准局部手术、放疗和蒽环类药物治疗，同正常的TLR4患者相比，携带TLR4Asp299Gly等位基因的患者出现转移的时间更快，提示TLR4 Asp299Gly是病情进展的独立预后因子。因此，选择性免疫缺陷（DC调节的抗原递呈）使患者的抗癌治疗显著降低。

5 联合治疗的临床意义

很多随机对照的临床试验将传统的抗癌治疗与免疫治疗联合，提示化疗与免疫治疗存在协同作用。

29例对一线铂类药物耐药的晚期小细胞肺癌，使用转染p53腺病毒的DC疫苗治疗。23例患者出现肿瘤进展，再使用紫杉醇或卡铂解救化疗，反应率又达到61.5%或38%，但使用疫苗后的1年生存不比历史对照好。另外，回顾性研究分析了胶质母细胞瘤中，多肽负载和分解物负载的DC对传统治疗的影响。发现化疗与之前使用的疫苗治疗存在协同，延长患者的生存时间。作者认为，以胶质母细胞瘤分泌的TRP2作为免疫治疗的靶点可以增加细胞死亡的敏感性。

在前列腺癌和其他晚期癌症中，DNA疫苗与化疗的联合也显示出令人鼓舞的协同作用。对疫苗特异性免疫存在反应的患者对解救化疗也存在反应，反之则没有反应。然而，联合治疗的剂量和给药时间如何才能达到最佳的治疗效果，以及关键的指征和肿瘤类型仍需进一步研究。

6 结论和展望

传统抗癌治疗可以从免疫系统的参与中获益。免疫系统通过2种方式发挥作用:一种启动非经典凋亡通路，诱导肿瘤细胞的免疫原性。另一种是细胞毒药物消除免疫抑制，上调免疫因子的表达。此外，针对癌症特异抗原的疫苗能够增加随后化疗药物的敏感性。

将来，内科医生可能需要整合4个参数来设计最优的治疗方案——前面3个是宿主的，后面1个是肿瘤本身的。

首先，癌症免疫流行病学，将可以决定哪个多态性和突变可以指示癌症患者的治疗结果。如TLR4、IL-10和IL-18的基因多态性可以影响乳腺癌、淋巴瘤、卵巢癌的治疗。同样，IgG的Fc受体的基因多态性也可影响单克隆抗体的疗效。其次，肿瘤的耐受机制，包括抑制性细胞（Treg细胞、T调节1细胞、骨髓抑制细胞和耐受DC）或免疫抑制因子，可以使用特异治疗来克服（耗竭性抗体、细胞因子拮抗剂或免疫刺激性小分子）。第三，化疗和放疗对宿主防御系统的细微影响必须被避免。同样，以放化疗作为新辅助化疗可能在免疫上比辅助治疗更重要，而且化疗必需按时进行，以至于避免无根据的抑制免疫反应。第四，为寻找最优的联合治疗（或理想的治疗靶点），肿瘤细胞的免疫学特征必需使用高通量（Omics）方法寻找。