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TRIzol法同时提取RNA,DNA,蛋白质
TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol试剂有多组分分离作用,与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比,最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质.TRIzol使样品匀浆化,细胞裂解,溶解细胞内含物,同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后,溶液分为水相和有机相,RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA;用乙醇沉淀中间层可回收DNA;用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。
TRIzol试剂可用于小量样品(50-100mg组织、5×106细胞)也适用于大量样品(≥1g组织、>107细胞)。对人,动物,植物组织,细菌均适用,可同时处理大量不同样品,整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染,可用于Northern Blot,dot blot,ployA筛选,体外翻译,RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内,建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品,避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准,比较不同样品RNA的得率,也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于Western Blotting。
规格:100ml 黄色透明液体
储存条件:2-8℃避光保存12个月
注意:请勿直接接触皮肤或吞咽,以免灼伤。如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗。忌用乙醇擦洗,乙醇会加重灼伤程度。
预防RNase污染注意事项:
1.经常更换新手套,皮肤上常带有的细菌,霉菌可能成为RNase的来源。
2.使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。
3.RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染,但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时,塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分钟,然后用水彻底清洗,高压灭菌,即可去除RNase。
4.配制溶液应使用无RNase的水(将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中,加入DEPC至终浓度0.01℅v/v,放置过夜,高压灭菌。注:DEPC有致癌之嫌,需小心操作。)
RNA的提取
准备试剂:氯仿,异丙醇,75℅乙醇,无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
9. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟,弃上清。
10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥,过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl无RNase的水或0.5℅SDS,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解,-70℃保存。
注意事项:
1.从少量样品(1-10mg组织或102-104细胞)中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品,沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来,糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成,也不影响PCR反应。
2.匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
3.分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机,2600×g离心30-60分钟。
预期产量:1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为:
肝和脾6-10μg ,肾3-4μg ,骨骼肌和脑组织1-1.5μg ,胎盘1-4μg ,上皮细胞8-15μg ,成纤维细胞5-7μg 。
常见问题分析:
得率低:A.样品裂解或匀浆处理不彻底
B.RNA沉淀未完全溶解
A260/A280<1.65 :A.检测吸光度时,RNA样品没有溶于水,而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高
B.样品匀浆时加的试剂量太少
C.匀浆样品时未在室温放置5分钟
D.吸取水相时混入了有机相
E.RNA沉淀未完全溶解。
RNA降解:A.组织取出后没有马上处理或冷冻
B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃
C.细胞在用胰酶处理时过度
D.溶液或离心管未经RNase去除处理
E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5
DNA污染: A. 样品匀浆时加的试剂量太少
B.样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液
蛋白聚糖和多糖污染: 沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染,步骤7中,每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2M NaCl)混合离心,按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中,高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心,并加上以上操作步骤。
DNA的分离
准备试剂:乙醇 0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇) 75%乙醇 8mM NaOH
操作步骤:
1. 样品加氯仿分层后,移去上层水相,用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1ml TRIzol加0.3ml无水乙醇混匀,室温放置3分钟,2-8℃不超过2000×g离心5分钟。
2. 移去上清,(如需分离蛋白质,可保留,进一步操作见后)用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用1ml TRIzol加入1ml柠檬酸钠,室温放置30分钟,2-8℃2000×g离心5分钟,弃上清,重复一次。
3. 用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀,每用1ml TRIzol加入1.5-2 ml 75%乙醇,室温放置10-20分钟(不时颠倒混合)2-8℃2000×g离心5分钟, 弃上清。
4. 室温放置晾干DNA 5-15分钟,用8mM NaOH溶解DNA。从50-70mg组织或107细胞中分离的DNA溶于300-600μl 8mM NaOH,DNA的浓度通常为0.2-0.3μg/μl 。提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris缓冲液中,建议用弱碱溶解,8mMNaOH的pH值为9,溶解DNA后可用TE,HEPES调节pH。从某些样品(尤其是组织)中提取的DNA中可能包含一些胶状不溶物可>12000×g离心10分钟除去。
DNA的定量:取一份溶于8mM NaOH的DNA加水测A260值。一单位A260值相当于50μg/ml双链DNA。根据DNA产量可估计细胞数,人,大鼠,小鼠1×106二倍体细胞含DNA的量分别为7.1μg , 6.5μg , 5.8μg 。
预期产量:1mg组织或1×106细胞提取DNA分别为肝和肾3-4μg 骨骼肌,脑组织,胎盘2-3μg 人,大鼠,小鼠培养细胞(1×106)5-7μg 成纤维细胞5-7μg
应用:1.用于PCR 溶于8mM NaOH的DNA用0.1M HEPES调pH至8.4,取0.1-1μg DNA用作模板。
2.酶切反应 用HEPES或1mM EDTA调节pH至适当值。每μg DNA使用3-5单位的酶,80-90%的DNA是可消化的。
1ml 8mM NaOH溶解的DNA样品pH值调节
Final pH 0.1M HEPES(μl) Final pH 1M HEPES(μl)
8.4 86 7.2 23
8.2 93 7.0 32
8.0 101
7.8 117
7.5 159
注意事项:
1. DNA在中间层和有机相中时可在2-8℃保存过夜。
2.DNA沉淀在75%乙醇中2-8℃可保存几个月。
3.DNA在8mM NaOH溶液中4℃可放置过夜,如长期保存需用HEPES调节pH至7-8并且加EDTA至1mM,可置于4℃或-20℃长期保存。
常见问题分析:
得率低:A.样品匀浆和裂解的不彻底
B.最终得到的DNA沉淀没有完全溶解
A260/A280<1.70 :A. 检测吸光度时,RNA样品没有溶于水,而溶于了TE中
B.酚除去的不彻底,可用0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇)再洗一遍DNA沉淀。
DNA降解:A.组织取出后没有马上处理或冷冻
B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃
C.样品匀浆时使用了高速匀浆仪
RNA污染:A.氯仿分层后水相去除的不干净
B.DNA沉淀用0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇)洗的不彻底
蛋白质的提取
准备试剂:异丙醇 含0.3M盐酸胍的95%乙醇 无水乙醇 1%SDS
操作步骤:
1.取沉淀DNA后剩余的上清,用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml TRIzol加1.5ml异丙醇,室温放置10分钟,2-8℃12000×g离心10分钟弃上清。
2.用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1ml TRIzol加2ml洗涤液,室温放置20分钟,2-8℃7500×g离心5分钟,弃上清,重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。
3.真空抽干蛋白质沉淀5-10分钟,用1%SDS溶解蛋白质,反复吸打,50℃温浴使其完全溶解,不溶物2-8℃10000×g离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于Western Blot或-5至-20℃保存备用。
注意事项:
1.蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中2-8℃一个月以上或-5至-20℃一年以上。
2.用0.1% SDS在2-8℃透析三次,10000×g离心10分钟取上清即可用于Western Blot。
常见问题分析:
得率低:A.样品裂解或匀浆处理不彻底
B.最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解
蛋白质降解:组织取出后没有马上处理或冷冻
电泳时条带变形:蛋白质沉淀洗涤不充
TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol试剂有多组分分离作用,与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比,最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质.TRIzol使样品匀浆化,细胞裂解,溶解细胞内含物,同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后,溶液分为水相和有机相,RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA;用乙醇沉淀中间层可回收DNA;用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。
TRIzol试剂可用于小量样品(50-100mg组织、5×106细胞)也适用于大量样品(≥1g组织、>107细胞)。对人,动物,植物组织,细菌均适用,可同时处理大量不同样品,整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染,可用于Northern Blot,dot blot,ployA筛选,体外翻译,RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内,建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品,避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准,比较不同样品RNA的得率,也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于Western Blotting。
规格:100ml 黄色透明液体
储存条件:2-8℃避光保存12个月
注意:请勿直接接触皮肤或吞咽,以免灼伤。如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗。忌用乙醇擦洗,乙醇会加重灼伤程度。
预防RNase污染注意事项:
1.经常更换新手套,皮肤上常带有的细菌,霉菌可能成为RNase的来源。
2.使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。
3.RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染,但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时,塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分钟,然后用水彻底清洗,高压灭菌,即可去除RNase。
4.配制溶液应使用无RNase的水(将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中,加入DEPC至终浓度0.01℅v/v,放置过夜,高压灭菌。注:DEPC有致癌之嫌,需小心操作。)
RNA的提取
准备试剂:氯仿,异丙醇,75℅乙醇,无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
9. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟,弃上清。
10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥,过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl无RNase的水或0.5℅SDS,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解,-70℃保存。
注意事项:
1.从少量样品(1-10mg组织或102-104细胞)中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品,沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来,糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成,也不影响PCR反应。
2.匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
3.分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机,2600×g离心30-60分钟。
预期产量:1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为:
肝和脾6-10μg ,肾3-4μg ,骨骼肌和脑组织1-1.5μg ,胎盘1-4μg ,上皮细胞8-15μg ,成纤维细胞5-7μg 。
常见问题分析:
得率低:A.样品裂解或匀浆处理不彻底
B.RNA沉淀未完全溶解
A260/A280<1.65 :A.检测吸光度时,RNA样品没有溶于水,而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高
B.样品匀浆时加的试剂量太少
C.匀浆样品时未在室温放置5分钟
D.吸取水相时混入了有机相
E.RNA沉淀未完全溶解。
RNA降解:A.组织取出后没有马上处理或冷冻
B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃
C.细胞在用胰酶处理时过度
D.溶液或离心管未经RNase去除处理
E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5
DNA污染: A. 样品匀浆时加的试剂量太少
B.样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液
蛋白聚糖和多糖污染: 沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染,步骤7中,每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2M NaCl)混合离心,按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中,高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心,并加上以上操作步骤。
DNA的分离
准备试剂:乙醇 0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇) 75%乙醇 8mM NaOH
操作步骤:
1. 样品加氯仿分层后,移去上层水相,用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1ml TRIzol加0.3ml无水乙醇混匀,室温放置3分钟,2-8℃不超过2000×g离心5分钟。
2. 移去上清,(如需分离蛋白质,可保留,进一步操作见后)用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用1ml TRIzol加入1ml柠檬酸钠,室温放置30分钟,2-8℃2000×g离心5分钟,弃上清,重复一次。
3. 用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀,每用1ml TRIzol加入1.5-2 ml 75%乙醇,室温放置10-20分钟(不时颠倒混合)2-8℃2000×g离心5分钟, 弃上清。
4. 室温放置晾干DNA 5-15分钟,用8mM NaOH溶解DNA。从50-70mg组织或107细胞中分离的DNA溶于300-600μl 8mM NaOH,DNA的浓度通常为0.2-0.3μg/μl 。提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris缓冲液中,建议用弱碱溶解,8mMNaOH的pH值为9,溶解DNA后可用TE,HEPES调节pH。从某些样品(尤其是组织)中提取的DNA中可能包含一些胶状不溶物可>12000×g离心10分钟除去。
DNA的定量:取一份溶于8mM NaOH的DNA加水测A260值。一单位A260值相当于50μg/ml双链DNA。根据DNA产量可估计细胞数,人,大鼠,小鼠1×106二倍体细胞含DNA的量分别为7.1μg , 6.5μg , 5.8μg 。
预期产量:1mg组织或1×106细胞提取DNA分别为肝和肾3-4μg 骨骼肌,脑组织,胎盘2-3μg 人,大鼠,小鼠培养细胞(1×106)5-7μg 成纤维细胞5-7μg
应用:1.用于PCR 溶于8mM NaOH的DNA用0.1M HEPES调pH至8.4,取0.1-1μg DNA用作模板。
2.酶切反应 用HEPES或1mM EDTA调节pH至适当值。每μg DNA使用3-5单位的酶,80-90%的DNA是可消化的。
1ml 8mM NaOH溶解的DNA样品pH值调节
Final pH 0.1M HEPES(μl) Final pH 1M HEPES(μl)
8.4 86 7.2 23
8.2 93 7.0 32
8.0 101
7.8 117
7.5 159
注意事项:
1. DNA在中间层和有机相中时可在2-8℃保存过夜。
2.DNA沉淀在75%乙醇中2-8℃可保存几个月。
3.DNA在8mM NaOH溶液中4℃可放置过夜,如长期保存需用HEPES调节pH至7-8并且加EDTA至1mM,可置于4℃或-20℃长期保存。
常见问题分析:
得率低:A.样品匀浆和裂解的不彻底
B.最终得到的DNA沉淀没有完全溶解
A260/A280<1.70 :A. 检测吸光度时,RNA样品没有溶于水,而溶于了TE中
B.酚除去的不彻底,可用0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇)再洗一遍DNA沉淀。
DNA降解:A.组织取出后没有马上处理或冷冻
B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃
C.样品匀浆时使用了高速匀浆仪
RNA污染:A.氯仿分层后水相去除的不干净
B.DNA沉淀用0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇)洗的不彻底
蛋白质的提取
准备试剂:异丙醇 含0.3M盐酸胍的95%乙醇 无水乙醇 1%SDS
操作步骤:
1.取沉淀DNA后剩余的上清,用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml TRIzol加1.5ml异丙醇,室温放置10分钟,2-8℃12000×g离心10分钟弃上清。
2.用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1ml TRIzol加2ml洗涤液,室温放置20分钟,2-8℃7500×g离心5分钟,弃上清,重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。
3.真空抽干蛋白质沉淀5-10分钟,用1%SDS溶解蛋白质,反复吸打,50℃温浴使其完全溶解,不溶物2-8℃10000×g离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于Western Blot或-5至-20℃保存备用。
注意事项:
1.蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中2-8℃一个月以上或-5至-20℃一年以上。
2.用0.1% SDS在2-8℃透析三次,10000×g离心10分钟取上清即可用于Western Blot。
常见问题分析:
得率低:A.样品裂解或匀浆处理不彻底
B.最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解
蛋白质降解:组织取出后没有马上处理或冷冻
电泳时条带变形:蛋白质沉淀洗涤不充