紧急求救.非常急,关于引物
丁香园论坛
987
大家好,我都快急哭了,希望各位多多关照...
我刚进实验室,老板就给我一课题,就是做病毒外壳蛋白基因的原核表达,我查了大量资料,一点头绪都没有.首先我要设计引物,这是我最大的难题.因为没有人带我,只有自己摸索,万般无奈下,我只好来到丁香家园向大家求救.
下面是我课题一些情况:
我要作的病毒CP基因序列:
ORIGIN
1 atgggcacca acaagccagc cactctagct gatttgcaga aggcaattaa tggcatctca
61 aaagatgcgt tgaattacct gactgctcat aaagctgatg ttgtgacttt tgctggtcag
121 atagagtatg caggctatga tgctgcaact ctgattggca tattgaagga caaaggtggt
181 gacacattgg ctaaggatat gactatgtgc atcaccatga ggtatgtgag aggcactggc
241 tttgtgagag atgtcaccaa gaaagtgaaa gtggcggctg gaagcactga ggcttcaacc
301 ttagtgtcaa ggtatgggat agtgtcctct gtgggatcaa atgccaatgc catcacactt
361 gggaggttgg ctcagctatt cccaaatgtc tcacatgaag ttgtgcgaca aatttctggt
421 gttaagatgg ctgtggactc ttctgatctg gggctgacag gatgtgacaa cttactgtgg
481 gactatgttc cacaatacat caaactggag agtgagacag ctccttactg cacaactcac
541 tcccttagtc acatcttgtt tgttgtgcac atcattcact ccttccaaat aactaaaaag
601 accatgccag agggtaagaa gaaggagcgt ggtctgacaa aggacataga catgatgaag
661 tacacaactg gtctcctggt catcacatgc aagtcaaaga acttgattga caagaagaag
721 gaggatggta gaaagaaggt cttagatgaa ttcatcacca atgggaaagt gaagaccaca
781 atcttcgatg cactggctgg tatgtctgtc aacacgatca gtacatatgg aaaccagacc
841 aagctgtact tggctcaaca gagcaagctg atgaagatcc ttgctgagaa cacttcaaag
901 acagcaacag aagtcagcgg gttggtgaag gaattcttcg aggatgaagc agaaggtgca
961 gatgactag
我查资料获得的信息为:
一\用做克隆 转化农杆菌以在植物中表达此序列的引物为:
C1 5ˊCG(GGATCC)GTT CAG TCT AGT CAT CTG CAC 3ˊ
(括号中GGATCC为BamH1酶切位点)
C2 5ˊCG(GAGCTC)TAG AAT GGG TAC CAA CAA GCC 3ˊ
(括号中GAGCTC为Sac1酶切位点)
克隆载体为PGEM-T EASY VECTOR SYSTEM,用BamH1和Sac1做酶切鉴定
二\只用做克隆的引物为
CP1: 5′GTTCAGTCTAGTCATCTGCAC 3′(无酶切位点)
CP2: 5′TAGAATGGGTACCAACAAGCCA 3′(无酶切位点)
虽然外行的很,但通过查资料,我也总结了下面几个问题,希望大家不要见笑,请高手指点,不胜感谢:
1/如果只将目的基因用做克隆测序而不做表达,是不是引物设计时不需要加酶切位点,原因是什么?就是说PCR产物与克隆载体连接的原理是什么?
2/如果将基因克隆后再做原核(真核)表达,这样就要求引物设计时加酶切位点对吗,为什么?
3/引物的 酶切位点是不是要与表达载体的酶切位点一致,对克隆载体有没有要求?
4/用相应的酶对质粒进行酶切时,是不是要求该酶在目的基因序列中没有对应的酶切位点?
5/在引物上加入酶切位点时,是不是要考虑表达载体中有相应的酶切位点和目的基因序列中没有此限制性酶切位点?
6/通过软件分析,我得知该基因序列中有EcoR1酶的限制性酶切位点,那么设计引物时是不是就不能加入EcoR1酶酶切位点
7/GST表达系统是不是能保持表达后的蛋白较高比率的活性,我如果用该表达系统(大家都知道该系统有三个酶切位点:EcoR1 BamH1 和Sma1),那么还可以在引物上加上EcoR1 酶切位点吗?
8/我如果用PMD-18T克隆载体和GST表达系统,对引物设计有什么要求,该怎样设计,谢谢.
附:EcoR1 酶切位点:GAATTC
Sma1酶切位点:CCCGGG
BamH1酶切位点:GGATCC
这样,我的引物该怎样设计?十分感谢!!!!!
焦急地等待着您的答复
我刚进实验室,老板就给我一课题,就是做病毒外壳蛋白基因的原核表达,我查了大量资料,一点头绪都没有.首先我要设计引物,这是我最大的难题.因为没有人带我,只有自己摸索,万般无奈下,我只好来到丁香家园向大家求救.
下面是我课题一些情况:
我要作的病毒CP基因序列:
ORIGIN
1 atgggcacca acaagccagc cactctagct gatttgcaga aggcaattaa tggcatctca
61 aaagatgcgt tgaattacct gactgctcat aaagctgatg ttgtgacttt tgctggtcag
121 atagagtatg caggctatga tgctgcaact ctgattggca tattgaagga caaaggtggt
181 gacacattgg ctaaggatat gactatgtgc atcaccatga ggtatgtgag aggcactggc
241 tttgtgagag atgtcaccaa gaaagtgaaa gtggcggctg gaagcactga ggcttcaacc
301 ttagtgtcaa ggtatgggat agtgtcctct gtgggatcaa atgccaatgc catcacactt
361 gggaggttgg ctcagctatt cccaaatgtc tcacatgaag ttgtgcgaca aatttctggt
421 gttaagatgg ctgtggactc ttctgatctg gggctgacag gatgtgacaa cttactgtgg
481 gactatgttc cacaatacat caaactggag agtgagacag ctccttactg cacaactcac
541 tcccttagtc acatcttgtt tgttgtgcac atcattcact ccttccaaat aactaaaaag
601 accatgccag agggtaagaa gaaggagcgt ggtctgacaa aggacataga catgatgaag
661 tacacaactg gtctcctggt catcacatgc aagtcaaaga acttgattga caagaagaag
721 gaggatggta gaaagaaggt cttagatgaa ttcatcacca atgggaaagt gaagaccaca
781 atcttcgatg cactggctgg tatgtctgtc aacacgatca gtacatatgg aaaccagacc
841 aagctgtact tggctcaaca gagcaagctg atgaagatcc ttgctgagaa cacttcaaag
901 acagcaacag aagtcagcgg gttggtgaag gaattcttcg aggatgaagc agaaggtgca
961 gatgactag
我查资料获得的信息为:
一\用做克隆 转化农杆菌以在植物中表达此序列的引物为:
C1 5ˊCG(GGATCC)GTT CAG TCT AGT CAT CTG CAC 3ˊ
(括号中GGATCC为BamH1酶切位点)
C2 5ˊCG(GAGCTC)TAG AAT GGG TAC CAA CAA GCC 3ˊ
(括号中GAGCTC为Sac1酶切位点)
克隆载体为PGEM-T EASY VECTOR SYSTEM,用BamH1和Sac1做酶切鉴定
二\只用做克隆的引物为
CP1: 5′GTTCAGTCTAGTCATCTGCAC 3′(无酶切位点)
CP2: 5′TAGAATGGGTACCAACAAGCCA 3′(无酶切位点)
虽然外行的很,但通过查资料,我也总结了下面几个问题,希望大家不要见笑,请高手指点,不胜感谢:
1/如果只将目的基因用做克隆测序而不做表达,是不是引物设计时不需要加酶切位点,原因是什么?就是说PCR产物与克隆载体连接的原理是什么?
2/如果将基因克隆后再做原核(真核)表达,这样就要求引物设计时加酶切位点对吗,为什么?
3/引物的 酶切位点是不是要与表达载体的酶切位点一致,对克隆载体有没有要求?
4/用相应的酶对质粒进行酶切时,是不是要求该酶在目的基因序列中没有对应的酶切位点?
5/在引物上加入酶切位点时,是不是要考虑表达载体中有相应的酶切位点和目的基因序列中没有此限制性酶切位点?
6/通过软件分析,我得知该基因序列中有EcoR1酶的限制性酶切位点,那么设计引物时是不是就不能加入EcoR1酶酶切位点
7/GST表达系统是不是能保持表达后的蛋白较高比率的活性,我如果用该表达系统(大家都知道该系统有三个酶切位点:EcoR1 BamH1 和Sma1),那么还可以在引物上加上EcoR1 酶切位点吗?
8/我如果用PMD-18T克隆载体和GST表达系统,对引物设计有什么要求,该怎样设计,谢谢.
附:EcoR1 酶切位点:GAATTC
Sma1酶切位点:CCCGGG
BamH1酶切位点:GGATCC
这样,我的引物该怎样设计?十分感谢!!!!!
焦急地等待着您的答复
