我对引物设计的一些建议(原创）
丁香园论坛
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我对引物设计的一些建议
很多人都想学会引物设计及软件的应用，这些其实很简单，看看书大致原则就清楚了，但仍然很少有书介绍引物的设计流程，我将自己的一点体会在这里和大家交流。但愿初学者能有所收获。
1．首先要明确设计引物的目的。是检测还是构建，是克隆还是表达，表达还分原核与真核表达之分。
检测：一般说来，检测引物的设计相对简单。但若要求特异性，则需分析被检测的基因是否有高度同源性，这一般在引物设计完后在genbank上blast就可以了。只要两条引物不同时与其他基因高度同源(尤其是3’端)不互补。若被检测基因存在选择性剪接，则最好引物能跨过不同的剪接位点。
克隆构建：一般根据需要选择被构建的区段。当然引物的5’端要加酶切位点了。
原核表达载体的构建：大多是真核基因在原核表达。这就需要清楚真核基因的cDNA，因为原核不能切除内含子。基因的5’非编码序列要去除。而且如果此基因的产物是分泌型的，还要把信号肽去掉，因为原核无法识别真核的信号肽，不能切除。所以就不一定是从ATG开始了。这要求根据参考文献查找此基因的信号肽的位置。往往原核表达载体提供了ATG密码子，所以若利用载体上的ATG，目的基因的ATG就要去除，否则会影响翻译的准确性和效率。当然3’的非编码序列也要去掉。
真核表达载体的构建：真核基因在真核表达相对比前者简单。理论上可以用基因组DNA或cDNA，但大都用cDNA。而且要保留5’和3’的非编码序列，5’的非编码序列最好保留80bp以上，因为5’非编码序列与翻译的效率有关，在18～80bp范围内，随着碱基数增加翻译的效率也增加。所以尽可能保留多一些的5’非编码序列。至于3’非编码序列，目前研究也与翻译有关，所以构建时我们也是尽可能保留一些。
2．设计引物前要明确所查找的基因
往往在genbank上查找基因时会遇到很多序列出现，使得初学者无法确定自己的目的基因的序列。这有很多原因，首先在搜索前要输入明确的关键词，选清种属，还有你想要的是基因组还是mRNA或cDNA。另外即使输入正确也难免多个基因的序列出现，这也不难，只要找到你想要的基因就可以了，但是还会出现同一个基因的序列有多个，这其中包括两种情况：
A．早些年对cDNA或mRNA的测序技术没有现在完善，往往只测了部分序列，不同的实验室的测序结果有交叉，尤其是非编码序列部分，所以通过软件就可以将这些序列比较一下，发现其中的不同部分。
B．而对于近几年的基因，由于可以测得全部序列，所以出现多个序列，则是选择性剪接造成的。一般在后面会表明variant的字样。至于你要选哪个，则需根据你课题的要求来选择了。
3．明确信息序列
很多人查到了序列后，准备设计引物了，但由于一些概念上的错误导致引物设计错误。Genbank上查得的cDNA序列并不是于mRNA互补的序列，所有网络或文献给的序列全部是信息序列，所谓信息序列就是与蛋白质、mRNA的序列一致，所以此处的cDNA与mRNA的序列一致，并不互补。那么上游引物（或称sense primer or forward primer）就是与查到的序列一样了，在序列的上游。另一引物即下游引物（或称antisense primer or downward primer）与所查到的序列互补，在序列的3’端。
明确了这些概念目的后再设计引物就是比较简单的事了，已有很多帖子谈过，我也不赘述了。希望对大家有帮助。若有不足之处，请交流指正。
很多人都想学会引物设计及软件的应用，这些其实很简单，看看书大致原则就清楚了，但仍然很少有书介绍引物的设计流程，我将自己的一点体会在这里和大家交流。但愿初学者能有所收获。
1．首先要明确设计引物的目的。是检测还是构建，是克隆还是表达，表达还分原核与真核表达之分。
检测：一般说来，检测引物的设计相对简单。但若要求特异性，则需分析被检测的基因是否有高度同源性，这一般在引物设计完后在genbank上blast就可以了。只要两条引物不同时与其他基因高度同源(尤其是3’端)不互补。若被检测基因存在选择性剪接，则最好引物能跨过不同的剪接位点。
克隆构建：一般根据需要选择被构建的区段。当然引物的5’端要加酶切位点了。
原核表达载体的构建：大多是真核基因在原核表达。这就需要清楚真核基因的cDNA，因为原核不能切除内含子。基因的5’非编码序列要去除。而且如果此基因的产物是分泌型的，还要把信号肽去掉，因为原核无法识别真核的信号肽，不能切除。所以就不一定是从ATG开始了。这要求根据参考文献查找此基因的信号肽的位置。往往原核表达载体提供了ATG密码子，所以若利用载体上的ATG，目的基因的ATG就要去除，否则会影响翻译的准确性和效率。当然3’的非编码序列也要去掉。
真核表达载体的构建：真核基因在真核表达相对比前者简单。理论上可以用基因组DNA或cDNA，但大都用cDNA。而且要保留5’和3’的非编码序列，5’的非编码序列最好保留80bp以上，因为5’非编码序列与翻译的效率有关，在18～80bp范围内，随着碱基数增加翻译的效率也增加。所以尽可能保留多一些的5’非编码序列。至于3’非编码序列，目前研究也与翻译有关，所以构建时我们也是尽可能保留一些。
2．设计引物前要明确所查找的基因
往往在genbank上查找基因时会遇到很多序列出现，使得初学者无法确定自己的目的基因的序列。这有很多原因，首先在搜索前要输入明确的关键词，选清种属，还有你想要的是基因组还是mRNA或cDNA。另外即使输入正确也难免多个基因的序列出现，这也不难，只要找到你想要的基因就可以了，但是还会出现同一个基因的序列有多个，这其中包括两种情况：
A．早些年对cDNA或mRNA的测序技术没有现在完善，往往只测了部分序列，不同的实验室的测序结果有交叉，尤其是非编码序列部分，所以通过软件就可以将这些序列比较一下，发现其中的不同部分。
B．而对于近几年的基因，由于可以测得全部序列，所以出现多个序列，则是选择性剪接造成的。一般在后面会表明variant的字样。至于你要选哪个，则需根据你课题的要求来选择了。
3．明确信息序列
很多人查到了序列后，准备设计引物了，但由于一些概念上的错误导致引物设计错误。Genbank上查得的cDNA序列并不是于mRNA互补的序列，所有网络或文献给的序列全部是信息序列，所谓信息序列就是与蛋白质、mRNA的序列一致，所以此处的cDNA与mRNA的序列一致，并不互补。那么上游引物（或称sense primer or forward primer）就是与查到的序列一样了，在序列的上游。另一引物即下游引物（或称antisense primer or downward primer）与所查到的序列互补，在序列的3’端。
明确了这些概念目的后再设计引物就是比较简单的事了，已有很多帖子谈过，我也不赘述了。希望对大家有帮助。若有不足之处，请交流指正。
