【共享】RT-PCR疑难解答
丁香园论坛
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做RT-PCR可能遇到的一些问题,自己对症下药吧
问 题1.
RT-PCR 灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物
可能原因:
1) RNA被降解
建议:
使用前在变性胶上分析RNA以验证完整性
使用良好的无污染技术分离RNA
在将组织从动物体取出后立刻处理
在100%甲酰胺中储存RNA
2)RNA中包含逆转录抑制剂
建议:
通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70% (v/v) 乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元 (0.25μg到0.4μg /μl) 以帮助小量样品RNA的恢复。
逆转录抑制剂包括:SDS, EDTA, 甘油,焦磷酸钠,亚精胺,甲酰胺和胍盐。
将对照RNA同样品混合,同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。
3)多糖同RNA共沉淀
使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
4)用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火
建议:
确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体,建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。
对于基因特异性引物 (GSP),可以试一下其他GSP,或换用oligo(dT) 或随机六聚体,确定GSP是反义序列。
5)起始RNA量不够
建议:
增加RNA量。
对于<50 ng的RNA样品,可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。
6)RNA模板二级结构太多
建议:
将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火
提高逆转录反应温度,对SuperScriptⅡ可以到50℃,对ThermoScript可以到65℃。
注意:不要在>60℃时使用oligo(dT)引物,选择一个在反应温度可以退火 的GSP。对于>1 kb的RT-PCR产物,保持反应温度≤65℃。
注意:不要在高于37℃时使用M-MLV。
如果不需要全长cDNA,在第一链反应中使用随机引物。
7)引物或模板对残余的RNA模板敏感
建议:在PCR前用RNaseH处理。
8)靶序列在分析的组织中不表达
建议:尝试其他靶序列或组织。
9)PCR没有起作用
建议: 对两步法RT-PCR,不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物。
问题2
RT-PCR时在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带
1)引物和模板非特异性退火
在第一链合成中使用GSP,而不是随机引物或oligo (dT)。
试用允许高温cDNA合成的GSP。
2)GSP设计较差
遵循用于扩增引物设计的同样原则。
3)RNA中沾染了基因组DNA
使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。
问题3
定量RT-PCR无扩增产物,相对荧光信号≤背景或没有模板对照
可能原因:
1)无cDNA合成
2)cDNA合成温度太高,低引物效率。降低保温温度
3)反转录或cDNA产物被二级结构封闭。提高保温温度。重新设计引物
4)RNA被损害或降解。更换RNA
5)RNAse污染。维持无菌条件;加入RNase抑制剂。
6)荧光探针无功能。
确保探针设计的有效性和fluorophore 和quencher的存在。
用DNase处理TaqMan探针,检验荧光是否增强。
必要的话重新设计或合成探针。
问题4
灵敏度低,须在比预期更高的循环中检出产物
1)初始模板RNA不充分。
增加模板RNA的浓度;使用10ng-1μg的总RNA
2)RNA被损害或降解。
必要的话更换RNA
3)RNAse污染。
维持无菌条件;加入RNase抑制剂
4)无效的cDNA合成。
通过增加70%乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂
5)无效的PCR扩增。
调整cDNA合成温度或引物设计。反转录的抑制剂包括SDS,EDTA,胍盐,甲酰胺,磷酸钠和亚精胺。
问题5
信号高于预期,在低于预期的循环中即可检出产物
1)反应中加的样品太多。
减低模板的浓度
2模板或PCR残余污染。
隔离污染来源,更换试剂
使用专用的精致移液器。在无DNA区域准备反应,使用抗气溶胶的吸头。
问题6
电泳后出现意外的条带
1)RNA被基因组DNA污染。
用DNase I预处理RNA
2)用于第一链合成的寡聚dT或随机引物。
使用基因特异性引物
3)PCR的低特异性。
优化PCR条件
4)形成引物二聚体
设计在3'端没有互补序列的引物。
5)引物和模板非特异性退火
以2℃到5℃间隔增加退火温度,减少退火时间。
在开始几个循环使用较高的退火温度,然后使用较低的退火温度。
使用Taq DNA进行自动热启动PCR。
避免在引物3'端含有2到3个dG或dC。
6)镁离子浓度太高
对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。
7)因为扩增复杂模板导致引物错误起始
使用巢式PCR或递减PCR。
8)沾染外源DNA
使用抗气雾剂的吸头和UDG。
9)因为二级结构导致引物结合位点无法接近
问 题1.
RT-PCR 灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物
可能原因:
1) RNA被降解
建议:
使用前在变性胶上分析RNA以验证完整性
使用良好的无污染技术分离RNA
在将组织从动物体取出后立刻处理
在100%甲酰胺中储存RNA
2)RNA中包含逆转录抑制剂
建议:
通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70% (v/v) 乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元 (0.25μg到0.4μg /μl) 以帮助小量样品RNA的恢复。
逆转录抑制剂包括:SDS, EDTA, 甘油,焦磷酸钠,亚精胺,甲酰胺和胍盐。
将对照RNA同样品混合,同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。
3)多糖同RNA共沉淀
使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
4)用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火
建议:
确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体,建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。
对于基因特异性引物 (GSP),可以试一下其他GSP,或换用oligo(dT) 或随机六聚体,确定GSP是反义序列。
5)起始RNA量不够
建议:
增加RNA量。
对于<50 ng的RNA样品,可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。
6)RNA模板二级结构太多
建议:
将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火
提高逆转录反应温度,对SuperScriptⅡ可以到50℃,对ThermoScript可以到65℃。
注意:不要在>60℃时使用oligo(dT)引物,选择一个在反应温度可以退火 的GSP。对于>1 kb的RT-PCR产物,保持反应温度≤65℃。
注意:不要在高于37℃时使用M-MLV。
如果不需要全长cDNA,在第一链反应中使用随机引物。
7)引物或模板对残余的RNA模板敏感
建议:在PCR前用RNaseH处理。
8)靶序列在分析的组织中不表达
建议:尝试其他靶序列或组织。
9)PCR没有起作用
建议: 对两步法RT-PCR,不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物。
问题2
RT-PCR时在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带
1)引物和模板非特异性退火
在第一链合成中使用GSP,而不是随机引物或oligo (dT)。
试用允许高温cDNA合成的GSP。
2)GSP设计较差
遵循用于扩增引物设计的同样原则。
3)RNA中沾染了基因组DNA
使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。
问题3
定量RT-PCR无扩增产物,相对荧光信号≤背景或没有模板对照
可能原因:
1)无cDNA合成
2)cDNA合成温度太高,低引物效率。降低保温温度
3)反转录或cDNA产物被二级结构封闭。提高保温温度。重新设计引物
4)RNA被损害或降解。更换RNA
5)RNAse污染。维持无菌条件;加入RNase抑制剂。
6)荧光探针无功能。
确保探针设计的有效性和fluorophore 和quencher的存在。
用DNase处理TaqMan探针,检验荧光是否增强。
必要的话重新设计或合成探针。
问题4
灵敏度低,须在比预期更高的循环中检出产物
1)初始模板RNA不充分。
增加模板RNA的浓度;使用10ng-1μg的总RNA
2)RNA被损害或降解。
必要的话更换RNA
3)RNAse污染。
维持无菌条件;加入RNase抑制剂
4)无效的cDNA合成。
通过增加70%乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂
5)无效的PCR扩增。
调整cDNA合成温度或引物设计。反转录的抑制剂包括SDS,EDTA,胍盐,甲酰胺,磷酸钠和亚精胺。
问题5
信号高于预期,在低于预期的循环中即可检出产物
1)反应中加的样品太多。
减低模板的浓度
2模板或PCR残余污染。
隔离污染来源,更换试剂
使用专用的精致移液器。在无DNA区域准备反应,使用抗气溶胶的吸头。
问题6
电泳后出现意外的条带
1)RNA被基因组DNA污染。
用DNase I预处理RNA
2)用于第一链合成的寡聚dT或随机引物。
使用基因特异性引物
3)PCR的低特异性。
优化PCR条件
4)形成引物二聚体
设计在3'端没有互补序列的引物。
5)引物和模板非特异性退火
以2℃到5℃间隔增加退火温度,减少退火时间。
在开始几个循环使用较高的退火温度,然后使用较低的退火温度。
使用Taq DNA进行自动热启动PCR。
避免在引物3'端含有2到3个dG或dC。
6)镁离子浓度太高
对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。
7)因为扩增复杂模板导致引物错误起始
使用巢式PCR或递减PCR。
8)沾染外源DNA
使用抗气雾剂的吸头和UDG。
9)因为二级结构导致引物结合位点无法接近