【原创】HLA高低分辨分型试剂（HLA-A、B、C、DR、DQ、DP）
丁香园论坛
7282
上海迈程医疗器械有限公司
专业提供DNA/RNA快速提取试剂、HLA高低分辨分型（A,B,C,DR,DQ），B27位点检测及分子生物学耗材试剂。
愿意真诚为您服务！
请致电：18930640599 mail:jason725@139.com
由美国德州生物基因有限公司（Texas BioGene,Inc）生产出新型新型HLA- ABDR SSP Morgan?试剂盒，该试剂根据亚洲人种特点而独特设计，可用于HLA I类A,B位点和Ⅱ类DR位点等位基因低分辨分型检测。试剂独特的96套引物设计，不仅可以扩增涵盖所有Tissue Antigen（International Nomenclature Committee of WHO）中所包括所有等位基因，同时还可以扩增自1996年到2009年Tissue Antigen 杂志中发布的所有新等位基因。SSP Morgan TM 试剂具有可靠、简便以及重复性高等显著特点。
1）Morgan TM System HLA-ABDR 操作手册
一，试剂盒组成：
1.试剂分为1×96、2×96、4×96四个类型，每个test 含有96个引物。
2.8M buffer----612μl/管。
注意：使用前请在-20度保存
3.热循环反应封板纸。
4.引物特异性列表、判读表。
5.新版本判读软件光盘，光盘含有在Morgan TM系统中所包括的所有试剂的分析软件
没有提供的原材料、试剂及仪器
1.Taq 酶。
2.双蒸水。
3.96孔V型板用热循环仪－——本试剂盒是按照Perkins Elmer 9700 PCR仪标准设计的。
4.0.5×TBE电泳缓冲溶液。
5.电泳系统（德克萨斯生物公司提供凝胶系统）。
6.DNA 分子量标。
7.电泳电源。
二，DNA样品准备
一切可以分离得到高质量DNA样品的方法均可以应用。（强烈推荐使用本公司生产的BioGene-FastTM以及ExpuzeTM DNA 提取试剂盒）
1.血样应该收集到用EDTA或者ACD处理过的抗凝管中。
2.提取DNA样品存度要求：
A260/A280比值应大于1.65
凝胶电泳在分子量略大于10kb左右在出现清晰的一条带。
3.DNA样品浓度要求在10－80ng/μl（Morgan TM系统可以允许DNA浓度在较大的范围内变化）。
三，PCR 准备
1.将配型试剂，8M buffer，DNA样品，Taq酶等相关试剂放在架子上。
2.严格按照以下步骤配置PCR反应液
容量（ul/孔）总数（ul）
DNA(10-30ng/ul)2.0204
8M buffer6.0612
Taq酶(5u/ul)0.044.5
总数8.0820.5
在8M buffer 小管中加入浓度位5U/μl Taq酶4.5μl，混匀，在每个test的第一孔加入8μl作为质控。 加入204μl DNA样品到上面试管中（8M buffer /Taq 酶），充分混匀。
3.在剩下的各孔中加入8μl上述混合液
4.用耐热封口纸封好试剂板。
5.压上热垫，进行PCR扩增
四，扩增程序
本公司DNA配型试剂是按照Perkin ElmerAmp 9600和9700标准设计的 。每次扩增时间大约1小时25分钟。
SegmentCycle numberTemperatureTime
1112℃5 min
2196℃2.5 min
31095℃20 sec
65℃60 sec
42295℃15 sec
62℃50 sec
72℃30 sec
514 ℃Until removed
五，胶电泳
1.用DNA级的琼脂糖和0.5× TBE缓冲液配置浓度为2.5％的琼脂糖凝胶。当应用德克萨斯凝胶系统时，每块96孔胶需要70 ml 2.5％琼脂糖溶液。
2．按照次序依次每孔加入6μl PCR 扩增产物（＃1 空用黑色的小点标记）。
3. 凝胶在每厘米10伏特电压下电泳，知道红色的色带离加样孔0.7－1.0厘米，电泳结束。
4. 将凝胶取出放在紫外成像系统中。
六，阅读凝胶
1.每条电泳道（除了第一条电泳道）都会显示大小位600 bp 的内部质控带
2.应用计算机软件或者判读表对阳性条带进行配型，以得到DNA样品的HLA型号。
3.污染监测孔（第1孔）中出现阳性特异带，结果无效。
4.如果内部指控以及特意性条带均没有出现表明反应失败。
5.非特异性条带，出现的条带大小和标准不一致，出现的原因是由于不明原因的非特异性扩增。去掉这些条带，再进行判读。
常出现问题以及解决方法
1.没有扩增出条带或条带不清晰。可能的原因以及相关的解决方法：
a.肝素影响：用Expuze TM 试剂盒分离提取DNA
b.DNA质量不高：用Expuze TM 试剂盒纯化DNA，或者用该试剂盒重新提取DNA样品
c.DNA样品量不够：增加DNA量
d.抑制物的存在：将DNA样品加热到95℃ 5分钟，然后进行PCR反应或者是再次分离DNA
e.Tap酶活力不对：联系Taq酶供应商，或者咨询德克萨斯生物科技有限公司以便获得好品牌的Taq酶。
2.非特异性阳性条带的出现。可能的原因以及相关的解决方法：
a.过量的DNA或者过量的Taq酶：重新测定DNA浓度并调整DNA的加样量；小心精确的量取DNA酶。
b.不准确的热循环温度：校对热循环温度。
c.DNA被别的DNA污染：从原来的血浆中重新分离DNA样品。
3.非特异性阴性条带的出现。可能的原因以及相关的解决方法：
a.不准确的热循环温度：校对热循环温度。
b.DNA、ddH2O以及Taq酶混合不均匀：在加入反应孔前充分的混合。
上海迈程医疗器械有限公司 专业提供DNA/RNA快速提取试剂、HLA高低分辨分型（A,B,C,DR,DQ），B27位点检测及分子生物学耗材试剂。
愿意真诚为您服务！
请致电：18930640599 mail:jason725@139.com
专业提供DNA/RNA快速提取试剂、HLA高低分辨分型（A,B,C,DR,DQ），B27位点检测及分子生物学耗材试剂。
愿意真诚为您服务！
请致电：18930640599 mail:jason725@139.com
由美国德州生物基因有限公司（Texas BioGene,Inc）生产出新型新型HLA- ABDR SSP Morgan?试剂盒，该试剂根据亚洲人种特点而独特设计，可用于HLA I类A,B位点和Ⅱ类DR位点等位基因低分辨分型检测。试剂独特的96套引物设计，不仅可以扩增涵盖所有Tissue Antigen（International Nomenclature Committee of WHO）中所包括所有等位基因，同时还可以扩增自1996年到2009年Tissue Antigen 杂志中发布的所有新等位基因。SSP Morgan TM 试剂具有可靠、简便以及重复性高等显著特点。
1）Morgan TM System HLA-ABDR 操作手册
一，试剂盒组成：
1.试剂分为1×96、2×96、4×96四个类型，每个test 含有96个引物。
2.8M buffer----612μl/管。
注意：使用前请在-20度保存
3.热循环反应封板纸。
4.引物特异性列表、判读表。
5.新版本判读软件光盘，光盘含有在Morgan TM系统中所包括的所有试剂的分析软件
没有提供的原材料、试剂及仪器
1.Taq 酶。
2.双蒸水。
3.96孔V型板用热循环仪－——本试剂盒是按照Perkins Elmer 9700 PCR仪标准设计的。
4.0.5×TBE电泳缓冲溶液。
5.电泳系统（德克萨斯生物公司提供凝胶系统）。
6.DNA 分子量标。
7.电泳电源。
二，DNA样品准备
一切可以分离得到高质量DNA样品的方法均可以应用。（强烈推荐使用本公司生产的BioGene-FastTM以及ExpuzeTM DNA 提取试剂盒）
1.血样应该收集到用EDTA或者ACD处理过的抗凝管中。
2.提取DNA样品存度要求：
A260/A280比值应大于1.65
凝胶电泳在分子量略大于10kb左右在出现清晰的一条带。
3.DNA样品浓度要求在10－80ng/μl（Morgan TM系统可以允许DNA浓度在较大的范围内变化）。
三，PCR 准备
1.将配型试剂，8M buffer，DNA样品，Taq酶等相关试剂放在架子上。
2.严格按照以下步骤配置PCR反应液
容量（ul/孔）总数（ul）
DNA(10-30ng/ul)2.0204
8M buffer6.0612
Taq酶(5u/ul)0.044.5
总数8.0820.5
在8M buffer 小管中加入浓度位5U/μl Taq酶4.5μl，混匀，在每个test的第一孔加入8μl作为质控。 加入204μl DNA样品到上面试管中（8M buffer /Taq 酶），充分混匀。
3.在剩下的各孔中加入8μl上述混合液
4.用耐热封口纸封好试剂板。
5.压上热垫，进行PCR扩增
四，扩增程序
本公司DNA配型试剂是按照Perkin ElmerAmp 9600和9700标准设计的 。每次扩增时间大约1小时25分钟。
SegmentCycle numberTemperatureTime
1112℃5 min
2196℃2.5 min
31095℃20 sec
65℃60 sec
42295℃15 sec
62℃50 sec
72℃30 sec
514 ℃Until removed
五，胶电泳
1.用DNA级的琼脂糖和0.5× TBE缓冲液配置浓度为2.5％的琼脂糖凝胶。当应用德克萨斯凝胶系统时，每块96孔胶需要70 ml 2.5％琼脂糖溶液。
2．按照次序依次每孔加入6μl PCR 扩增产物（＃1 空用黑色的小点标记）。
3. 凝胶在每厘米10伏特电压下电泳，知道红色的色带离加样孔0.7－1.0厘米，电泳结束。
4. 将凝胶取出放在紫外成像系统中。
六，阅读凝胶
1.每条电泳道（除了第一条电泳道）都会显示大小位600 bp 的内部质控带
2.应用计算机软件或者判读表对阳性条带进行配型，以得到DNA样品的HLA型号。
3.污染监测孔（第1孔）中出现阳性特异带，结果无效。
4.如果内部指控以及特意性条带均没有出现表明反应失败。
5.非特异性条带，出现的条带大小和标准不一致，出现的原因是由于不明原因的非特异性扩增。去掉这些条带，再进行判读。
常出现问题以及解决方法
1.没有扩增出条带或条带不清晰。可能的原因以及相关的解决方法：
a.肝素影响：用Expuze TM 试剂盒分离提取DNA
b.DNA质量不高：用Expuze TM 试剂盒纯化DNA，或者用该试剂盒重新提取DNA样品
c.DNA样品量不够：增加DNA量
d.抑制物的存在：将DNA样品加热到95℃ 5分钟，然后进行PCR反应或者是再次分离DNA
e.Tap酶活力不对：联系Taq酶供应商，或者咨询德克萨斯生物科技有限公司以便获得好品牌的Taq酶。
2.非特异性阳性条带的出现。可能的原因以及相关的解决方法：
a.过量的DNA或者过量的Taq酶：重新测定DNA浓度并调整DNA的加样量；小心精确的量取DNA酶。
b.不准确的热循环温度：校对热循环温度。
c.DNA被别的DNA污染：从原来的血浆中重新分离DNA样品。
3.非特异性阴性条带的出现。可能的原因以及相关的解决方法：
a.不准确的热循环温度：校对热循环温度。
b.DNA、ddH2O以及Taq酶混合不均匀：在加入反应孔前充分的混合。
上海迈程医疗器械有限公司 专业提供DNA/RNA快速提取试剂、HLA高低分辨分型（A,B,C,DR,DQ），B27位点检测及分子生物学耗材试剂。
愿意真诚为您服务！
请致电：18930640599 mail:jason725@139.com
