自我总结的Westen Blot步骤，简单实用！
丁香园论坛
3203
自我总结的Westen Blot步骤，简单实用！
蛋白质的提取
（整个过程冰上进行）
一．组织膜蛋白
裂解液 bufferA+1%蛋白酶抑制剂
蛋白保存液 40%SDS+60%RIPA+1%蛋白酶抑制剂
1.-80°C冰箱中取出组织放入研磨管中（研磨管和配套的研磨棒事先用去离子水冲洗，用纸吸干水)按600-700μl/100mg组织加裂解液研磨（研磨后研磨管和研磨棒用去离子水冲洗，用纸吸干水）
2.用1000枪转入1.5ml离心管中4°C离心，1500转15min
3.用1000枪将上清转入差速离心专用离心管中（离心管事先用去离子水冲洗）用裂解液配平
4.差速离心33000-35000转（45000g）30min
5.弃上清，沉淀加入150μl左右蛋白保存液（根据沉淀的量调整）用枪来回吹打使沉淀溶解，枪头在液面下，尽量不要出沫
6.将上述液体分装到0.5ml离心管中，每管20-25μl，留一管-20°C保存测浓度，其余放入-80°C保存
二．组织总蛋白
裂解液 40%SDS+60%RIPA+1%蛋白酶抑制剂
1.-80°C冰箱中取出组织放入研磨管中（研磨管和配套的研磨棒事先要用去离子水冲洗，用干净的纸擦干)按600-700μl/100mg组织加裂解液研磨（研磨后研磨管和研磨棒用去离子水冲洗，用纸吸干水）
2.用1000枪转入1.5ml离心管中4°C离心，13500转30min
3.取上清分装到0.5ml离心管中，每管20-25μl，留一管-20°C保存测浓度，其余放入-80°C保存
三．细胞总蛋白
裂解液 RIPA+1%蛋白酶抑制剂
1.将培养瓶中培养液倒掉，加入PBS冲洗5-6遍，倒掉PBS，用枪吸出倒不尽的PBS
2.每瓶加100-150μl裂解液，用细胞刮刀尽量将细胞刮下来（刮刀用前去离子水冲洗，用纸吸干水，用完一样处理）用200枪转入1.5ml离心管中
3.超声破碎细胞，频率80-100间，超声探头（用前用纸擦，用后用纸擦并盖上盖）插入液面下，超声3-5s停3-5s，总共20s左右，停止5min左右
4.重复上步4-6次
5.4°C离心13500转15min
6.取上清分装到0.5ml离心管中，每管40μl，留一管-20°C保存测浓度，其余放入-80°C保存。
蛋白质浓度的测定
工作液（BCA试剂B液：BCA试剂A液=1：50）
1.用100枪将19μl PBS加入96孔板（两边不加，测浓度不准）
2.用2.5枪加入1μl待测样品（加样时枪头在液面下，提抢时贴壁，尽量不产生气泡)
3.用200枪加入200μl工作液，混匀（枪头在液面下，不产生气泡）
4.放入37°C孵箱30min
5.用酶标仪测浓度，记录数据
凝胶的配置
一． 分离胶的配置：
1. 将胶板用自来水冲洗干净（否则配出的胶会不均匀），用去离子水冲洗。将胶板固定在架子上，加入去离子水至矮板高度，等待3~4分钟，测试是否漏水。期间可以准备配胶时所需要的溶液：
去离子水：室温放置
30%丙烯酰胺：4℃放置，神经毒性
TRIS—HCL（ph8.8）：4℃放置
TRIS—HCL（ph6.8）：4℃放置
10%SDS（自配）：室温放置
10%AP（现配现用）：避光
TEMED：室温放置，神经毒性
2. 根据所需蛋白质的分子量确定所要配制多大浓度的胶。本实验采用的胶为10%的分离胶，2块胶版配置25ml即可。按照如下的量进行配制分离胶：
去离子水：9.9ml
30%丙烯酰胺：8.3ml
TRIS—HCL（ph8.8）：6.3ml
10%SDS（自配）：0.25ml
10%AP（现配现用）：0.25ml
TEMED：0.01ml
配置时要将液体混匀，加入最后两种物质的速度要快，因为丙烯酰胺是促凝剂，凝聚的物质为APH和TEMED。将配好的分离胶倒入胶板中（倒入量为胶板高度的3/4）加入去离子水封住，防止空气进入，排除气泡。加去离子水时要轻，防止将上层的分离胶稀释。通常分离胶需要30~35分钟即可，凝固后可以看到用一条直线。
3. 在配好的分离胶上层加入TRIS—HCL（ph6.8）作为一种缓冲，因为积层胶用的是TRIS—HCL（ph6.8）。然后配制积层胶：
去离子水：5.5ml
30%丙烯酰胺：3.5ml
TRIS—HCL（ph6.8）：1.5ml
10%SDS（自配）：0.08ml
10%AP（现配现用）：0.08ml
TEMED：0.008ml
配好后将TRIS—HCL倒出，倒入积层胶，插入梳子（梳子要用去离子水冲洗干净，并将去离子水甩掉，否则会在胶板上留下不能用的孔道），插梳子的时候要排除气泡，从一端向另一端推。20分钟即可凝固，拔出梳子。
将配好的胶板放入装有去离子水的饭盒中，防止胶中的水分蒸发，发生缩胶现象。
电泳液和转膜液的配制
1. 电泳液：Gly15.0g，Tris-base3.02g，SDS1g，1000ml 去离子水，室温保存
2. 转膜液：Gly14.4g，Tris-base3.00g，甲醇100ml，900ml去离子水，4℃保存
蛋白质样本的处理
1. 从-80℃冰箱中取出提好的蛋白质，按照算好的蛋白，ripa,loading将蛋白稀释到同一个体积。（此操作过程在冰域中进行）
蛋白质的体积 X= 40μg/[（1.348undefinedOD值-0.0799）20~Q~Kbr_~H~M~2~1Ripa的体积 Y=体积最大的蛋白质补整-X
Loading的体积Z=1/4(X+Y)
2. 煮样：100℃，5min。（将管外的水擦干净）
电泳过程
1. 将电泳槽准备好，胶板的矮面朝里，加入电泳液，先在里面和外面个加入一半的电泳液，排净气泡后加满。
2. 上样，上样量为8μl。上样时要慢，如果担心样的中央处有凹陷，那就在边处让样流下。
3. 按照“红对红，黑对黑”的原则安装电极。开始跑电泳。先恒压70v使蛋白质跑到同一条起跑线上，待跑至分离胶上时，改为100v，使溴酚蓝全部跑出时停止。电压越小跑的越好。
转膜过程
1.剪好滤纸和NC膜，滤纸要比膜小1~2cm，在转膜液中浸泡。
2.准备白色的矮一些的盒子，里面装好转膜液，将膜取下，取得过程中要注意不要将膜弄破。
3.制作“三明治”，夹板黑色的一面朝向桌子，第一层为海绵，第二层为滤纸，第三层为胶，第四层为滤纸，这时不要急于将最后一层海绵盖上，先将前面三层中的气泡赶走，然后再加入第五层海绵。夹紧，不要让夹板扭动。
4.放入“三明治”时要按照“黑对黑”的原则放入。在倒满转膜液之前不要忘记将一个冰盒放在转膜槽内。将转膜槽放在装满冰的盆里，开始转膜。我们需要的分子量范围是：>250kd~31kd，我们转膜的条件为恒压70v，2h。
封闭
1. 封闭液的配制（5%）：将10g脱脂奶粉加入到200mlPBS中，在漏斗中过滤。
2. 将膜取出，放在去离子水中冲洗一下，放入封闭液中。
3. 放在摇床上封闭2h。
一抗的孵育
1. 将膜从封闭液中取出，用PBS冲洗3次，每次10min。按照分子量将膜剪开。
2. 一抗有两种孵育方法：一、室温孵育：在桌面上铺一张纸，将剪好的膜放在纸上，加上相应的一抗。二、过夜孵育：准备夹链袋，将膜用镊子放入，但是不能碰到膜的表面，将抗体加入，不能有气泡。在室温下摇动1h（可以将枪按到一档）4℃过夜。
3. APP(1:200),Navβ2（1：200），Nav1.2(1:200),NR1(1:200),BACE1(1:1000),GAPDH(1:1000)
二抗的孵育
1. 将膜从夹链袋中取出,一抗回收放在PBST中冲洗3次，10min一次。
2. 二抗在暗室中进行，GAPDH二抗用800鼠（1：4000），其他用700兔（1：4000）。
3. 二抗孵育1h。
4. 洗膜：PBST冲洗3次，每次10min。最后再用PBS冲洗一次。扫膜。
蛋白质的提取
（整个过程冰上进行）
一．组织膜蛋白
裂解液 bufferA+1%蛋白酶抑制剂
蛋白保存液 40%SDS+60%RIPA+1%蛋白酶抑制剂
1.-80°C冰箱中取出组织放入研磨管中（研磨管和配套的研磨棒事先用去离子水冲洗，用纸吸干水)按600-700μl/100mg组织加裂解液研磨（研磨后研磨管和研磨棒用去离子水冲洗，用纸吸干水）
2.用1000枪转入1.5ml离心管中4°C离心，1500转15min
3.用1000枪将上清转入差速离心专用离心管中（离心管事先用去离子水冲洗）用裂解液配平
4.差速离心33000-35000转（45000g）30min
5.弃上清，沉淀加入150μl左右蛋白保存液（根据沉淀的量调整）用枪来回吹打使沉淀溶解，枪头在液面下，尽量不要出沫
6.将上述液体分装到0.5ml离心管中，每管20-25μl，留一管-20°C保存测浓度，其余放入-80°C保存
二．组织总蛋白
裂解液 40%SDS+60%RIPA+1%蛋白酶抑制剂
1.-80°C冰箱中取出组织放入研磨管中（研磨管和配套的研磨棒事先要用去离子水冲洗，用干净的纸擦干)按600-700μl/100mg组织加裂解液研磨（研磨后研磨管和研磨棒用去离子水冲洗，用纸吸干水）
2.用1000枪转入1.5ml离心管中4°C离心，13500转30min
3.取上清分装到0.5ml离心管中，每管20-25μl，留一管-20°C保存测浓度，其余放入-80°C保存
三．细胞总蛋白
裂解液 RIPA+1%蛋白酶抑制剂
1.将培养瓶中培养液倒掉，加入PBS冲洗5-6遍，倒掉PBS，用枪吸出倒不尽的PBS
2.每瓶加100-150μl裂解液，用细胞刮刀尽量将细胞刮下来（刮刀用前去离子水冲洗，用纸吸干水，用完一样处理）用200枪转入1.5ml离心管中
3.超声破碎细胞，频率80-100间，超声探头（用前用纸擦，用后用纸擦并盖上盖）插入液面下，超声3-5s停3-5s，总共20s左右，停止5min左右
4.重复上步4-6次
5.4°C离心13500转15min
6.取上清分装到0.5ml离心管中，每管40μl，留一管-20°C保存测浓度，其余放入-80°C保存。
蛋白质浓度的测定
工作液（BCA试剂B液：BCA试剂A液=1：50）
1.用100枪将19μl PBS加入96孔板（两边不加，测浓度不准）
2.用2.5枪加入1μl待测样品（加样时枪头在液面下，提抢时贴壁，尽量不产生气泡)
3.用200枪加入200μl工作液，混匀（枪头在液面下，不产生气泡）
4.放入37°C孵箱30min
5.用酶标仪测浓度，记录数据
凝胶的配置
一． 分离胶的配置：
1. 将胶板用自来水冲洗干净（否则配出的胶会不均匀），用去离子水冲洗。将胶板固定在架子上，加入去离子水至矮板高度，等待3~4分钟，测试是否漏水。期间可以准备配胶时所需要的溶液：
去离子水：室温放置
30%丙烯酰胺：4℃放置，神经毒性
TRIS—HCL（ph8.8）：4℃放置
TRIS—HCL（ph6.8）：4℃放置
10%SDS（自配）：室温放置
10%AP（现配现用）：避光
TEMED：室温放置，神经毒性
2. 根据所需蛋白质的分子量确定所要配制多大浓度的胶。本实验采用的胶为10%的分离胶，2块胶版配置25ml即可。按照如下的量进行配制分离胶：
去离子水：9.9ml
30%丙烯酰胺：8.3ml
TRIS—HCL（ph8.8）：6.3ml
10%SDS（自配）：0.25ml
10%AP（现配现用）：0.25ml
TEMED：0.01ml
配置时要将液体混匀，加入最后两种物质的速度要快，因为丙烯酰胺是促凝剂，凝聚的物质为APH和TEMED。将配好的分离胶倒入胶板中（倒入量为胶板高度的3/4）加入去离子水封住，防止空气进入，排除气泡。加去离子水时要轻，防止将上层的分离胶稀释。通常分离胶需要30~35分钟即可，凝固后可以看到用一条直线。
3. 在配好的分离胶上层加入TRIS—HCL（ph6.8）作为一种缓冲，因为积层胶用的是TRIS—HCL（ph6.8）。然后配制积层胶：
去离子水：5.5ml
30%丙烯酰胺：3.5ml
TRIS—HCL（ph6.8）：1.5ml
10%SDS（自配）：0.08ml
10%AP（现配现用）：0.08ml
TEMED：0.008ml
配好后将TRIS—HCL倒出，倒入积层胶，插入梳子（梳子要用去离子水冲洗干净，并将去离子水甩掉，否则会在胶板上留下不能用的孔道），插梳子的时候要排除气泡，从一端向另一端推。20分钟即可凝固，拔出梳子。
将配好的胶板放入装有去离子水的饭盒中，防止胶中的水分蒸发，发生缩胶现象。
电泳液和转膜液的配制
1. 电泳液：Gly15.0g，Tris-base3.02g，SDS1g，1000ml 去离子水，室温保存
2. 转膜液：Gly14.4g，Tris-base3.00g，甲醇100ml，900ml去离子水，4℃保存
蛋白质样本的处理
1. 从-80℃冰箱中取出提好的蛋白质，按照算好的蛋白，ripa,loading将蛋白稀释到同一个体积。（此操作过程在冰域中进行）
蛋白质的体积 X= 40μg/[（1.348undefinedOD值-0.0799）20~Q~Kbr_~H~M~2~1Ripa的体积 Y=体积最大的蛋白质补整-X
Loading的体积Z=1/4(X+Y)
2. 煮样：100℃，5min。（将管外的水擦干净）
电泳过程
1. 将电泳槽准备好，胶板的矮面朝里，加入电泳液，先在里面和外面个加入一半的电泳液，排净气泡后加满。
2. 上样，上样量为8μl。上样时要慢，如果担心样的中央处有凹陷，那就在边处让样流下。
3. 按照“红对红，黑对黑”的原则安装电极。开始跑电泳。先恒压70v使蛋白质跑到同一条起跑线上，待跑至分离胶上时，改为100v，使溴酚蓝全部跑出时停止。电压越小跑的越好。
转膜过程
1.剪好滤纸和NC膜，滤纸要比膜小1~2cm，在转膜液中浸泡。
2.准备白色的矮一些的盒子，里面装好转膜液，将膜取下，取得过程中要注意不要将膜弄破。
3.制作“三明治”，夹板黑色的一面朝向桌子，第一层为海绵，第二层为滤纸，第三层为胶，第四层为滤纸，这时不要急于将最后一层海绵盖上，先将前面三层中的气泡赶走，然后再加入第五层海绵。夹紧，不要让夹板扭动。
4.放入“三明治”时要按照“黑对黑”的原则放入。在倒满转膜液之前不要忘记将一个冰盒放在转膜槽内。将转膜槽放在装满冰的盆里，开始转膜。我们需要的分子量范围是：>250kd~31kd，我们转膜的条件为恒压70v，2h。
封闭
1. 封闭液的配制（5%）：将10g脱脂奶粉加入到200mlPBS中，在漏斗中过滤。
2. 将膜取出，放在去离子水中冲洗一下，放入封闭液中。
3. 放在摇床上封闭2h。
一抗的孵育
1. 将膜从封闭液中取出，用PBS冲洗3次，每次10min。按照分子量将膜剪开。
2. 一抗有两种孵育方法：一、室温孵育：在桌面上铺一张纸，将剪好的膜放在纸上，加上相应的一抗。二、过夜孵育：准备夹链袋，将膜用镊子放入，但是不能碰到膜的表面，将抗体加入，不能有气泡。在室温下摇动1h（可以将枪按到一档）4℃过夜。
3. APP(1:200),Navβ2（1：200），Nav1.2(1:200),NR1(1:200),BACE1(1:1000),GAPDH(1:1000)
二抗的孵育
1. 将膜从夹链袋中取出,一抗回收放在PBST中冲洗3次，10min一次。
2. 二抗在暗室中进行，GAPDH二抗用800鼠（1：4000），其他用700兔（1：4000）。
3. 二抗孵育1h。
4. 洗膜：PBST冲洗3次，每次10min。最后再用PBS冲洗一次。扫膜。
