【原创/分享】GS115毕赤酵母表达外源蛋白较详细步骤！！！（从验证到阳性克隆的筛选）
丁香园论坛
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小弟把最近一个多月来所做的工作，做了个总结，供大家一起分享，希望版主能加分，现在我还是0分，很多帖子不能阅览，希望版主加分，今后我实验有了新的进展，我会把总结发上来，和大家一起分享。我做的是GS115表达VEGF，目前已经做到阳性克隆的筛选这一步。待以后再次做了总结，再与大家分享。希望大家支持，绝对原创！！！
一.实验材料
1．菌珠
E.coli DH5α
GS115酵母菌
2．质粒
PIC9K/VEGF165重组质粒
3．试剂
NB酵母氮源
G418
gl2、Not1、Sal1
山梨醇
质粒抽提液：溶液1，溶液2，溶液3
酚：氯仿（1：1）
rTaq、dNTP（2.5mM）、10×Buffer
上游引物VP5(25nmol/L):5’-TAGAATTCGCACCCATGGCAGAAGGAGG-3’
下游引物VP3(25nmol/L):5’-TAGCGGCCGCTTACCGCCTCGGCTTGTC-3’
4．仪器
电穿孔仪：Bio－Rad公司产品
Power/Pac 1000型电泳仪：Bio－Rad公司产品
Mini－垂直电泳槽：Bio－Rad公司产品
PCR仪
5． 各种培养基
（1） LB培养基
Peptone 10g
酵母抽提物 5g
氯化钠 10g
溶于蒸馏水，定容到1000ml，高压灭菌，121度20min。如做平板，则加15g 琼脂粉，待冷却至50度左右加入AMP至终浓度为50ug/ml。
（2） YPD培养基
Peptone 2g
酵母抽提物 1g
溶于蒸馏水，定容至96ml，高压灭菌121度20min，待冷却至室温后，加入4ml50％葡萄糖。做平板则加15g琼脂粉。
（3） MD平板
称15g琼脂粉与860ml蒸馏水中，高压灭菌121度20min，冷却至60度左右，依 次加入：
10×YNB 100ml
500×生物素 2ml
50％葡萄糖 40ml
混匀后迅速到如灭菌平板上。
（YNB，生物素，葡萄糖用0.22μM孔径的细菌滤器过滤除菌）
（4） MM平板
配法如MD平板，只是将甲醇替代葡萄糖，至终浓度为0.5%。
（5） YPD－G418平板
先配好YPD溶液，冷却至60度后加入不同量的100mg/ml的G418溶液。配称不同浓度的YPD－G418平板。（G418过滤除菌）
（6） BMGY/BMMY培养液
Peptone 20g
酵母抽提物 10g
溶于780ml蒸馏水中，高压灭菌121度20min，待冷至室温后，加入：
1M磷酸钾缓冲液（PH6.0） 100ml
10×YNB 100ml
500×生物素 2ml
50％甘油 20ml
如是BMMY培养液，则用甲醇代替甘油。
1M磷酸缓冲液：1M磷酸氢二钾 132ml
1M 磷酸二氢钾 868ml
溶于蒸馏水，用KOH调PH到6.0，定容至1000ml，高压灭菌121度20min。
二．实验内容
内容一：重组质粒的验证（由于长期保存，担心目的基因丢失）
1，电转DH5α
在60ul感受态细胞中加入连接液1ul，混匀，加入预冷的0.1cm的电转化杯中，调好电击参数（电压1200v,电阻200Ω，电容25uF），点击完毕，用1ml不含抗生物的LB培养液洗出，37度水浴放置50min，取100ul涂布氨卞平板（100mg/L），置于37度培养箱，过夜。
2，小提质粒
挑取阳性克隆于4ml氨卞培养液中，过夜培养。取1.5ml菌液12000rpm离心15s收集菌体
按照每毫升菌体加：溶液Ⅰ100ul（冰浴5min剧烈振荡）
溶液Ⅱ200ul（冰浴5min轻轻混匀）
溶液Ⅲ150ul（冰浴5min轻轻混匀）
12000rpm×5min
上清加入RNAse（10mg/ml）37度1hour后加入等体积酚：氯仿（1：1），剧烈振荡
12000rpm×5min
取上清，加入等体积氯仿，12000rpm，5min
上清加1/10体积3MNaCl和2体积无水乙醇
－20度沉淀10min后，用70％乙醇洗涤，晾干后加入适量适量双蒸水溶解
3．Pcr验证
DdH2O 14.2ul
10×buffer 2ul
dNTP（2.5mM） 2ul
上游引物VP5(25nmol/L) 0.5ul
下游引物VP3(25nmol/L) 0.5ul
质粒 0.5ul
rTaq 0.3ul
20ul体系
94度1min
94度5min 68度 45s ×30cycle 72度10min 4度保存
72度 1min
结果见图：
490bp
酶切验证：ddH2O 6ul
10×buffer 2ul
BSA 2ul
BglⅡ 1ul
NotⅠ 1ul
质粒 8ul
20ul体系
结果见图：
Pcr验证和酶切验证结果表明提取的质粒为重组质粒pPIC9K/VEGEF，可以大规模抽提质粒，供电转化酵母。
内容二：VEGF表达菌珠的筛选
1，大规模抽提验证成功的重组质粒（100ml菌液，方法同上）
2，重组质粒的线性化：
pPIC9K重组质粒 44ul
SalⅠ 1ul
10×buffer 5ul
50ul体系
37度酶切2h，65度灭活20min，1％琼脂糖电泳，检测。第一次用DNA回收试剂盒回收凝胶，但是回收率太低，因此线性化后直接考虑用1/10的NaAc和2倍体积的无水乙醇沉淀。加少量水溶解，取1ul检测。
3，制备酵母感受态：（1）挑菌于5mlYPD培养液中30度培养过夜。
（2）取0.1－0.5ml菌液于500ml新鲜YPD培养液中培养过夜，OD600＝1.3-1.5。
（3）离心，1500g，5min，4度。用500ml冰冷无菌水重悬菌体。
（4）离心，然后用250ml冰冷无菌水重悬。
（5）离心，然后用20ml冰冷山梨醇（1M）重悬。
（6）离心，用1ml冰冷山梨醇重悬。每管100ul分装于1mlep管中，－80度保存。
4，电打孔法转化酵母
把BIO-RADE电打孔仪调好个参数（电压1500v，电阻：200Ω，电容25uF），将线性化重组质粒15ul加入制备好的100ul酵母感受态细胞中，混匀，冰上预冷5min，转入0.2cm电打孔杯（预先放冰上预冷）中，置于冰上10min，放入电打孔仪，电击后取出，迅速放回冰上并加入1ml预冷1M山梨醇中，混匀，置于30度摇床震摇40min，吸取300ul涂布于MD平板上，30度培养2天。
5，阳性平板高拷贝克隆筛选
将MD平板上长出的His＋克隆，用3mlYPD培养液冲洗后，用涂棒涂匀，吸取菌苔液于1.5mlep管中，测定OD值为3.7。1OD＝5×107cells/ml，3.7OD＝1.85×108cells/ml，一般涂布浓度为105/200ul,因此稀释100倍。取200ul涂布于不同浓度梯度的YPD－G418平板上（浓度依次为：0.25,0.5,2.0,4.0,8.0mg/ml）。30度培养两天。
6，mut＋基因型的筛选
将在4.0,8.0mg/ml长出的高拷贝克隆，先点在MM平板上，再点在MD平板上，培养，观察两个平板上的生长情况。可是发现在MM平板上长的比MD平板上慢，以为时muts型了，但觉得这种方法来筛选mut＋不可靠，因此又决定用pcr验证来筛选。
步骤一：酵母基因组DNA的提取
取1ml菌液，离心弃上清，用100ul水清洗沉淀，加入100ulTE重悬，再加入10ul 5U/ul的zymolyase，30度作用30min，加入1ml酵母裂解液（100mmol/L，10mmol/LTris.HCl，25mmol/LEDTA，0.5%W/VSDS,蛋白酶k终浓度0.1mg/ml）65度水浴使其充分消化，加入等体积酚：氯仿（1：1），高速震荡3min，离心，收集上清，加入1/10的NaAc和2倍体积的无水乙醇沉淀,离心，70％乙醇洗涤，晾干后，收集沉淀，20ulddH2O溶解。
步骤2：用VEGF基因引物和AOX1基因引物分别进行pcr验证。
PCR1： H2O 12ul
10×buffer 2ul
DNTP 2ul
5’AOX1 1ul
3’AOX1 1ul
酵母基因组 1ul
rTaq 1ul
20ul体系
94度1min
94度2min 55度 1min ×30cycle 72度10min 4度保存
72度 1min
PCR2：DdH2O 14.2ul
10×buffer 2ul
dNTP（2.5mM） 2ul
上游引物VP5(25nmol/L) 0.5ul
下游引物VP3(25nmol/L) 0.5ul
质粒 0.5ul
rTaq 0.3ul
20ul体系
94度1min
94度5min 68度 45s ×30cycle 72度10min 4度保存
72度 1min
结果见图：
925bp 2100bp
490bp
一.实验材料
1．菌珠
E.coli DH5α
GS115酵母菌
2．质粒
PIC9K/VEGF165重组质粒
3．试剂
NB酵母氮源
G418
gl2、Not1、Sal1
山梨醇
质粒抽提液：溶液1，溶液2，溶液3
酚：氯仿（1：1）
rTaq、dNTP（2.5mM）、10×Buffer
上游引物VP5(25nmol/L):5’-TAGAATTCGCACCCATGGCAGAAGGAGG-3’
下游引物VP3(25nmol/L):5’-TAGCGGCCGCTTACCGCCTCGGCTTGTC-3’
4．仪器
电穿孔仪：Bio－Rad公司产品
Power/Pac 1000型电泳仪：Bio－Rad公司产品
Mini－垂直电泳槽：Bio－Rad公司产品
PCR仪
5． 各种培养基
（1） LB培养基
Peptone 10g
酵母抽提物 5g
氯化钠 10g
溶于蒸馏水，定容到1000ml，高压灭菌，121度20min。如做平板，则加15g 琼脂粉，待冷却至50度左右加入AMP至终浓度为50ug/ml。
（2） YPD培养基
Peptone 2g
酵母抽提物 1g
溶于蒸馏水，定容至96ml，高压灭菌121度20min，待冷却至室温后，加入4ml50％葡萄糖。做平板则加15g琼脂粉。
（3） MD平板
称15g琼脂粉与860ml蒸馏水中，高压灭菌121度20min，冷却至60度左右，依 次加入：
10×YNB 100ml
500×生物素 2ml
50％葡萄糖 40ml
混匀后迅速到如灭菌平板上。
（YNB，生物素，葡萄糖用0.22μM孔径的细菌滤器过滤除菌）
（4） MM平板
配法如MD平板，只是将甲醇替代葡萄糖，至终浓度为0.5%。
（5） YPD－G418平板
先配好YPD溶液，冷却至60度后加入不同量的100mg/ml的G418溶液。配称不同浓度的YPD－G418平板。（G418过滤除菌）
（6） BMGY/BMMY培养液
Peptone 20g
酵母抽提物 10g
溶于780ml蒸馏水中，高压灭菌121度20min，待冷至室温后，加入：
1M磷酸钾缓冲液（PH6.0） 100ml
10×YNB 100ml
500×生物素 2ml
50％甘油 20ml
如是BMMY培养液，则用甲醇代替甘油。
1M磷酸缓冲液：1M磷酸氢二钾 132ml
1M 磷酸二氢钾 868ml
溶于蒸馏水，用KOH调PH到6.0，定容至1000ml，高压灭菌121度20min。
二．实验内容
内容一：重组质粒的验证（由于长期保存，担心目的基因丢失）
1，电转DH5α
在60ul感受态细胞中加入连接液1ul，混匀，加入预冷的0.1cm的电转化杯中，调好电击参数（电压1200v,电阻200Ω，电容25uF），点击完毕，用1ml不含抗生物的LB培养液洗出，37度水浴放置50min，取100ul涂布氨卞平板（100mg/L），置于37度培养箱，过夜。
2，小提质粒
挑取阳性克隆于4ml氨卞培养液中，过夜培养。取1.5ml菌液12000rpm离心15s收集菌体
按照每毫升菌体加：溶液Ⅰ100ul（冰浴5min剧烈振荡）
溶液Ⅱ200ul（冰浴5min轻轻混匀）
溶液Ⅲ150ul（冰浴5min轻轻混匀）
12000rpm×5min
上清加入RNAse（10mg/ml）37度1hour后加入等体积酚：氯仿（1：1），剧烈振荡
12000rpm×5min
取上清，加入等体积氯仿，12000rpm，5min
上清加1/10体积3MNaCl和2体积无水乙醇
－20度沉淀10min后，用70％乙醇洗涤，晾干后加入适量适量双蒸水溶解
3．Pcr验证
DdH2O 14.2ul
10×buffer 2ul
dNTP（2.5mM） 2ul
上游引物VP5(25nmol/L) 0.5ul
下游引物VP3(25nmol/L) 0.5ul
质粒 0.5ul
rTaq 0.3ul
20ul体系
94度1min
94度5min 68度 45s ×30cycle 72度10min 4度保存
72度 1min
结果见图：
490bp
酶切验证：ddH2O 6ul
10×buffer 2ul
BSA 2ul
BglⅡ 1ul
NotⅠ 1ul
质粒 8ul
20ul体系
结果见图：
Pcr验证和酶切验证结果表明提取的质粒为重组质粒pPIC9K/VEGEF，可以大规模抽提质粒，供电转化酵母。
内容二：VEGF表达菌珠的筛选
1，大规模抽提验证成功的重组质粒（100ml菌液，方法同上）
2，重组质粒的线性化：
pPIC9K重组质粒 44ul
SalⅠ 1ul
10×buffer 5ul
50ul体系
37度酶切2h，65度灭活20min，1％琼脂糖电泳，检测。第一次用DNA回收试剂盒回收凝胶，但是回收率太低，因此线性化后直接考虑用1/10的NaAc和2倍体积的无水乙醇沉淀。加少量水溶解，取1ul检测。
3，制备酵母感受态：（1）挑菌于5mlYPD培养液中30度培养过夜。
（2）取0.1－0.5ml菌液于500ml新鲜YPD培养液中培养过夜，OD600＝1.3-1.5。
（3）离心，1500g，5min，4度。用500ml冰冷无菌水重悬菌体。
（4）离心，然后用250ml冰冷无菌水重悬。
（5）离心，然后用20ml冰冷山梨醇（1M）重悬。
（6）离心，用1ml冰冷山梨醇重悬。每管100ul分装于1mlep管中，－80度保存。
4，电打孔法转化酵母
把BIO-RADE电打孔仪调好个参数（电压1500v，电阻：200Ω，电容25uF），将线性化重组质粒15ul加入制备好的100ul酵母感受态细胞中，混匀，冰上预冷5min，转入0.2cm电打孔杯（预先放冰上预冷）中，置于冰上10min，放入电打孔仪，电击后取出，迅速放回冰上并加入1ml预冷1M山梨醇中，混匀，置于30度摇床震摇40min，吸取300ul涂布于MD平板上，30度培养2天。
5，阳性平板高拷贝克隆筛选
将MD平板上长出的His＋克隆，用3mlYPD培养液冲洗后，用涂棒涂匀，吸取菌苔液于1.5mlep管中，测定OD值为3.7。1OD＝5×107cells/ml，3.7OD＝1.85×108cells/ml，一般涂布浓度为105/200ul,因此稀释100倍。取200ul涂布于不同浓度梯度的YPD－G418平板上（浓度依次为：0.25,0.5,2.0,4.0,8.0mg/ml）。30度培养两天。
6，mut＋基因型的筛选
将在4.0,8.0mg/ml长出的高拷贝克隆，先点在MM平板上，再点在MD平板上，培养，观察两个平板上的生长情况。可是发现在MM平板上长的比MD平板上慢，以为时muts型了，但觉得这种方法来筛选mut＋不可靠，因此又决定用pcr验证来筛选。
步骤一：酵母基因组DNA的提取
取1ml菌液，离心弃上清，用100ul水清洗沉淀，加入100ulTE重悬，再加入10ul 5U/ul的zymolyase，30度作用30min，加入1ml酵母裂解液（100mmol/L，10mmol/LTris.HCl，25mmol/LEDTA，0.5%W/VSDS,蛋白酶k终浓度0.1mg/ml）65度水浴使其充分消化，加入等体积酚：氯仿（1：1），高速震荡3min，离心，收集上清，加入1/10的NaAc和2倍体积的无水乙醇沉淀,离心，70％乙醇洗涤，晾干后，收集沉淀，20ulddH2O溶解。
步骤2：用VEGF基因引物和AOX1基因引物分别进行pcr验证。
PCR1： H2O 12ul
10×buffer 2ul
DNTP 2ul
5’AOX1 1ul
3’AOX1 1ul
酵母基因组 1ul
rTaq 1ul
20ul体系
94度1min
94度2min 55度 1min ×30cycle 72度10min 4度保存
72度 1min
PCR2：DdH2O 14.2ul
10×buffer 2ul
dNTP（2.5mM） 2ul
上游引物VP5(25nmol/L) 0.5ul
下游引物VP3(25nmol/L) 0.5ul
质粒 0.5ul
rTaq 0.3ul
20ul体系
94度1min
94度5min 68度 45s ×30cycle 72度10min 4度保存
72度 1min
结果见图：
925bp 2100bp
490bp
