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转科技时空:王晓东蛋白纯化

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其实研究王晓东的科研思路,发现这个规律是相当明显的,他自己也曾在讲课时提到科研
的三板斧,其中的两板斧肯定是:建立体外生化检测系统,用这个系统跟踪蛋白纯化过程
。他的过人之处就在于他的实验室能用 100升的细胞,过5,6个column最终纯化得到单一
的生化组分。这个毅力有点像那个从几十万个猪脑提取某个激素的故事,他的实验比提激
素可能要简单,但是他提取的不是一个,而可能是几个,这几个将细胞调亡线粒体途径阐
述得相当干净明了(干净的意思是他用体内尤其是体外重建实验证明的,不像某些文章结
论模糊不清)。

建立体外检测系统,跟踪纯化蛋白这个思路如果有办法实现基本上是万能的,王用同样的
方法研究RNAi发现了RNAi pathway里一个很重要的蛋白就是一个例证。

有兴趣的同学可以读读他的文章
http://www.swmed.edu/home_pages/wanglab/Wanglab-pic/publications.htm

他的实验室主页
http://www.swmed.edu/home_pages/wanglab/

王晓东说世界上没有他纯化不出来的蛋白,呵呵。其实,他的lab纯化是很厉害,但决不至
于天下唯一。他们最初做出cytochrome c还是有些lucky的,

思路倒是比较直接,看上去比较简单,建立好体外检测系统,然后开始分离不同组分,结
合DNA ladder(他们用这个做凋亡检测体系),直到最后分离到单一有效组分为止。但事
实远不是这么简单,因为凋亡过程现在大家都知道,是多个蛋白参与,这就大大增加了分
离难度。同时重组4,5个组分不太可能,技术上现在几乎达不到(事实上,他们后来鉴定
了3个组分,加一个人工组分,这已经是很牛了,做过纯化的人就知道,光一个就要玩死好

多人)这里最关键的是体外凋亡系统的建立,分离是复杂烦琐的,所以体外检测系统一定
要简单,有良好的重复性,不然,大家可以想象这个纯化太难做了,或者说几乎不可能,
因为你所有的纯化都是以这个检测系统为指导的。

起初,他们想要建立这样一个检测系统,然后就搞一个细胞抽提物,当然它自身不会诱导
凋亡,然后他们就尝试加东西,加任何可以加的东西,只要能诱导凋亡就行。事实上王提
起往事,说,一直到他们快要绝望的时候,他们幸运地发现一个本来用来当作dATP的对照
,ddATP的东东可以强烈地诱导凋亡(当然,大家现在也应该意识到,他纯化的细胞组分里
,mitochondria是有一点破裂的,不然cytochrome c不会释放出来,凋亡也不可能发生,
这又是一个lucky的东东,呵呵),所以,后来他们把dATP提高到能诱导凋亡的浓度,这样
,才有可能做后面的分离纯化。事实上,分离出apoptosome里的几个组分到不需要绝顶高
手,(后面的工作才真正可以体现他lab的超强纯化能力)。从王lab出去的li peng现在s
ingapore,后来hongkong做出了另外两个mitochondria里释放出的蛋白也能诱导凋亡,其
实我看到很多做纯化很牛的实验室,在别的领域,要加入进来也是做东西的,但这个领域
通过这种方法再也做不出令人exciting的data了,包括王现在在做的,都是添砖加瓦的工
作。扯远了,呵呵。

后来大家都知道,那个apoptosome model,其中的dATP很重要,但实际上他的体外系统用
的dATP的浓度是体内的1k倍(更高?不记得了,有兴趣的可以自己去查.所以,体内真实情
况是和他这个model不完全一样的。

王觉得在生理dATP浓度下,一定有其它的因子参与了apoptosome的组装.在一篇正在revie
wing 的paper里,他通过借助chemical genetics方法筛选出的一个抑制凋亡的小分子,在
基于UV诱导的凋亡检测体系下(这样就去处了高浓度dATP的作用),纯化到另外两个分子
能够帮助组装apotosome。到时候大家看那篇paper,那才是纯化真功夫的显示。

我其实觉得王晓东过人之处并不在于他的纯化,前面说过,其实在其它领域也有很多用体
外系统来研究机制的牛lab,但王是第一个把这个系统引入apoptosis的人。所以,掘了第
一桶金。以前介绍过许田也是如此,第一个把tumor的概念引入drosophila,做出了漂亮的
工作。这个第一个才是重要的,王没有谈当时是否有忐忑的感受,但许是说了,他当时和
别人说这个idea之前,没有人理会他,倒是有不少嘲笑:)。我想,王在没找到ddATP之前
,也是极其郁闷的吧,这个时候,对自己的idea没有坚强的信念,是走不下去的。当然,
他也有一点点lucky:)

实际上,总有人固执地认为保守的是非常重要的,当然新的演化也是必须的和重要的。我
也觉得保守的通路不可被忽视。

关于凋亡的通路,就mammalian cell而言,现在主要集中在Death Receptor 和mitochond
r a pathway上,但这并不意味着这两条就是全部。

death receptor很重要,因为之不光介导stress-induced apoptosis,同时也介导免疫细
胞的apoptosis,体内实验也证实了这一点。而对mitochondria pathway事实上大部分数据
是建立在stress-induced apoptosis上,这个全世界都广为采用的系统极有可能夸大了c
ytochrome c的作用。因为实际上大家用的都是tumor cell line,而tumor的一大特征就是
获得avoid apoptosis的特性,所以,有可能mitochondria-independent apoptosis pat
hway 发生了loss/gain of function,而mitochondria pathway里的proteins stored in
mitochondria很少报道突变,比如cytochrome c,smac,Endo G。

通常这条pathway在tumor cell line里的变化只发生在其它调控蛋白上,比如BCL-2,XI
AP过表达之类。所以,一种解释可以说那些mitochondria蛋白有其它的生物学功能,对ce
llsurvival必须,所以,这样一来,就有可能使得在dish里培养的tumor cell line基本上
都依靠这条通路才能走向apoptosis。

所以,那篇genes&dev做出来的oncogene-induced apoptosis很重要,提示可能不光是st
ress,cytochrome c在其它的凋亡诱导途径中也起重要作用。早期作出来的是p53通过转录
下游effector作用在mitochondria上,这篇文章是c-myc。也许还有其它更多的,但可惜
现在还没有多少报道。

stress这种诱导方式太复杂,说不清楚,最终的结论还是要在体内得到才能下。有一点要说
明的是,caspase和mitochondria pathway是不能等同的。

相关蛋白的KO mice的建立也部分说明了mitochondria这条通路在发育中起重要作用。但这
些数据本身解释起来就很复杂,远远没有得出统一的结论,似乎这条pathway中的各个eff
ector都负责不同的组织的凋亡。

现在的热点,就象你说的,去研究cytochrome c和其它一大堆鬼东西怎么释放出来,真是
无聊极了,呵呵(个人喜好)。

我自己感觉在体内mitochondria pathway不是细胞首选自杀方式,改变现在的研究系统,
抛弃tumor cell line:)也许可以得出更多的有意思的东东。所以,线虫和果蝇才显得那
么重要,不然,有谁认为在果蝇里研究凋亡还有什么用?因为它们是in vivo,而不是仅仅
因为它们也保守。
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