转科技时空：王晓东蛋白纯化
丁香园论坛
1482
其实研究王晓东的科研思路，发现这个规律是相当明显的，他自己也曾在讲课时提到科研
的三板斧，其中的两板斧肯定是：建立体外生化检测系统，用这个系统跟踪蛋白纯化过程
。他的过人之处就在于他的实验室能用 100升的细胞，过5，6个column最终纯化得到单一
的生化组分。这个毅力有点像那个从几十万个猪脑提取某个激素的故事，他的实验比提激
素可能要简单，但是他提取的不是一个，而可能是几个，这几个将细胞调亡线粒体途径阐
述得相当干净明了（干净的意思是他用体内尤其是体外重建实验证明的，不像某些文章结
论模糊不清）。
建立体外检测系统，跟踪纯化蛋白这个思路如果有办法实现基本上是万能的，王用同样的
方法研究RNAi发现了RNAi pathway里一个很重要的蛋白就是一个例证。
有兴趣的同学可以读读他的文章
http://www.swmed.edu/home_pages/wanglab/Wanglab-pic/publications.htm
他的实验室主页
http://www.swmed.edu/home_pages/wanglab/
王晓东说世界上没有他纯化不出来的蛋白，呵呵。其实，他的lab纯化是很厉害，但决不至
于天下唯一。他们最初做出cytochrome c还是有些lucky的，
思路倒是比较直接，看上去比较简单，建立好体外检测系统，然后开始分离不同组分，结
合DNA ladder（他们用这个做凋亡检测体系），直到最后分离到单一有效组分为止。但事
实远不是这么简单，因为凋亡过程现在大家都知道，是多个蛋白参与，这就大大增加了分
离难度。同时重组4，5个组分不太可能，技术上现在几乎达不到（事实上，他们后来鉴定
了3个组分，加一个人工组分，这已经是很牛了，做过纯化的人就知道，光一个就要玩死好
多人）这里最关键的是体外凋亡系统的建立，分离是复杂烦琐的，所以体外检测系统一定
要简单，有良好的重复性，不然，大家可以想象这个纯化太难做了，或者说几乎不可能，
因为你所有的纯化都是以这个检测系统为指导的。
起初，他们想要建立这样一个检测系统，然后就搞一个细胞抽提物，当然它自身不会诱导
凋亡，然后他们就尝试加东西，加任何可以加的东西，只要能诱导凋亡就行。事实上王提
起往事，说，一直到他们快要绝望的时候，他们幸运地发现一个本来用来当作dATP的对照
，ddATP的东东可以强烈地诱导凋亡(当然，大家现在也应该意识到，他纯化的细胞组分里
，mitochondria是有一点破裂的，不然cytochrome c不会释放出来，凋亡也不可能发生，
这又是一个lucky的东东，呵呵)，所以，后来他们把dATP提高到能诱导凋亡的浓度，这样
，才有可能做后面的分离纯化。事实上，分离出apoptosome里的几个组分到不需要绝顶高
手，（后面的工作才真正可以体现他lab的超强纯化能力）。从王lab出去的li peng现在s
ingapore，后来hongkong做出了另外两个mitochondria里释放出的蛋白也能诱导凋亡，其
实我看到很多做纯化很牛的实验室，在别的领域，要加入进来也是做东西的，但这个领域
通过这种方法再也做不出令人exciting的data了，包括王现在在做的，都是添砖加瓦的工
作。扯远了，呵呵。
后来大家都知道，那个apoptosome model，其中的dATP很重要，但实际上他的体外系统用
的dATP的浓度是体内的1k倍（更高？不记得了，有兴趣的可以自己去查.所以，体内真实情
况是和他这个model不完全一样的。
王觉得在生理dATP浓度下，一定有其它的因子参与了apoptosome的组装.在一篇正在revie
wing 的paper里，他通过借助chemical genetics方法筛选出的一个抑制凋亡的小分子，在
基于UV诱导的凋亡检测体系下（这样就去处了高浓度dATP的作用），纯化到另外两个分子
能够帮助组装apotosome。到时候大家看那篇paper，那才是纯化真功夫的显示。
我其实觉得王晓东过人之处并不在于他的纯化，前面说过，其实在其它领域也有很多用体
外系统来研究机制的牛lab，但王是第一个把这个系统引入apoptosis的人。所以，掘了第
一桶金。以前介绍过许田也是如此，第一个把tumor的概念引入drosophila，做出了漂亮的
工作。这个第一个才是重要的，王没有谈当时是否有忐忑的感受，但许是说了，他当时和
别人说这个idea之前，没有人理会他，倒是有不少嘲笑：）。我想，王在没找到ddATP之前
，也是极其郁闷的吧，这个时候，对自己的idea没有坚强的信念，是走不下去的。当然，
他也有一点点lucky：）
实际上，总有人固执地认为保守的是非常重要的，当然新的演化也是必须的和重要的。我
也觉得保守的通路不可被忽视。
关于凋亡的通路，就mammalian cell而言，现在主要集中在Death Receptor 和mitochond
r a pathway上，但这并不意味着这两条就是全部。
death receptor很重要，因为之不光介导stress－induced apoptosis，同时也介导免疫细
胞的apoptosis，体内实验也证实了这一点。而对mitochondria pathway事实上大部分数据
是建立在stress－induced apoptosis上，这个全世界都广为采用的系统极有可能夸大了c
ytochrome c的作用。因为实际上大家用的都是tumor cell line，而tumor的一大特征就是
获得avoid apoptosis的特性，所以，有可能mitochondria－independent apoptosis pat
hway 发生了loss/gain of function，而mitochondria pathway里的proteins stored in
mitochondria很少报道突变，比如cytochrome c，smac，Endo G。
通常这条pathway在tumor cell line里的变化只发生在其它调控蛋白上，比如BCL－2，XI
AP过表达之类。所以，一种解释可以说那些mitochondria蛋白有其它的生物学功能，对ce
llsurvival必须，所以，这样一来，就有可能使得在dish里培养的tumor cell line基本上
都依靠这条通路才能走向apoptosis。
所以，那篇genes&dev做出来的oncogene－induced apoptosis很重要，提示可能不光是st
ress，cytochrome c在其它的凋亡诱导途径中也起重要作用。早期作出来的是p53通过转录
下游effector作用在mitochondria上，这篇文章是c－myc。也许还有其它更多的，但可惜
现在还没有多少报道。
stress这种诱导方式太复杂，说不清楚,最终的结论还是要在体内得到才能下。有一点要说
明的是，caspase和mitochondria pathway是不能等同的。
相关蛋白的KO mice的建立也部分说明了mitochondria这条通路在发育中起重要作用。但这
些数据本身解释起来就很复杂，远远没有得出统一的结论，似乎这条pathway中的各个eff
ector都负责不同的组织的凋亡。
现在的热点，就象你说的，去研究cytochrome c和其它一大堆鬼东西怎么释放出来，真是
无聊极了，呵呵（个人喜好）。
我自己感觉在体内mitochondria pathway不是细胞首选自杀方式，改变现在的研究系统，
抛弃tumor cell line：）也许可以得出更多的有意思的东东。所以，线虫和果蝇才显得那
么重要，不然，有谁认为在果蝇里研究凋亡还有什么用？因为它们是in vivo，而不是仅仅
因为它们也保守。
的三板斧，其中的两板斧肯定是：建立体外生化检测系统，用这个系统跟踪蛋白纯化过程
。他的过人之处就在于他的实验室能用 100升的细胞，过5，6个column最终纯化得到单一
的生化组分。这个毅力有点像那个从几十万个猪脑提取某个激素的故事，他的实验比提激
素可能要简单，但是他提取的不是一个，而可能是几个，这几个将细胞调亡线粒体途径阐
述得相当干净明了（干净的意思是他用体内尤其是体外重建实验证明的，不像某些文章结
论模糊不清）。
建立体外检测系统，跟踪纯化蛋白这个思路如果有办法实现基本上是万能的，王用同样的
方法研究RNAi发现了RNAi pathway里一个很重要的蛋白就是一个例证。
有兴趣的同学可以读读他的文章
http://www.swmed.edu/home_pages/wanglab/Wanglab-pic/publications.htm
他的实验室主页
http://www.swmed.edu/home_pages/wanglab/
王晓东说世界上没有他纯化不出来的蛋白，呵呵。其实，他的lab纯化是很厉害，但决不至
于天下唯一。他们最初做出cytochrome c还是有些lucky的，
思路倒是比较直接，看上去比较简单，建立好体外检测系统，然后开始分离不同组分，结
合DNA ladder（他们用这个做凋亡检测体系），直到最后分离到单一有效组分为止。但事
实远不是这么简单，因为凋亡过程现在大家都知道，是多个蛋白参与，这就大大增加了分
离难度。同时重组4，5个组分不太可能，技术上现在几乎达不到（事实上，他们后来鉴定
了3个组分，加一个人工组分，这已经是很牛了，做过纯化的人就知道，光一个就要玩死好
多人）这里最关键的是体外凋亡系统的建立，分离是复杂烦琐的，所以体外检测系统一定
要简单，有良好的重复性，不然，大家可以想象这个纯化太难做了，或者说几乎不可能，
因为你所有的纯化都是以这个检测系统为指导的。
起初，他们想要建立这样一个检测系统，然后就搞一个细胞抽提物，当然它自身不会诱导
凋亡，然后他们就尝试加东西，加任何可以加的东西，只要能诱导凋亡就行。事实上王提
起往事，说，一直到他们快要绝望的时候，他们幸运地发现一个本来用来当作dATP的对照
，ddATP的东东可以强烈地诱导凋亡(当然，大家现在也应该意识到，他纯化的细胞组分里
，mitochondria是有一点破裂的，不然cytochrome c不会释放出来，凋亡也不可能发生，
这又是一个lucky的东东，呵呵)，所以，后来他们把dATP提高到能诱导凋亡的浓度，这样
，才有可能做后面的分离纯化。事实上，分离出apoptosome里的几个组分到不需要绝顶高
手，（后面的工作才真正可以体现他lab的超强纯化能力）。从王lab出去的li peng现在s
ingapore，后来hongkong做出了另外两个mitochondria里释放出的蛋白也能诱导凋亡，其
实我看到很多做纯化很牛的实验室，在别的领域，要加入进来也是做东西的，但这个领域
通过这种方法再也做不出令人exciting的data了，包括王现在在做的，都是添砖加瓦的工
作。扯远了，呵呵。
后来大家都知道，那个apoptosome model，其中的dATP很重要，但实际上他的体外系统用
的dATP的浓度是体内的1k倍（更高？不记得了，有兴趣的可以自己去查.所以，体内真实情
况是和他这个model不完全一样的。
王觉得在生理dATP浓度下，一定有其它的因子参与了apoptosome的组装.在一篇正在revie
wing 的paper里，他通过借助chemical genetics方法筛选出的一个抑制凋亡的小分子，在
基于UV诱导的凋亡检测体系下（这样就去处了高浓度dATP的作用），纯化到另外两个分子
能够帮助组装apotosome。到时候大家看那篇paper，那才是纯化真功夫的显示。
我其实觉得王晓东过人之处并不在于他的纯化，前面说过，其实在其它领域也有很多用体
外系统来研究机制的牛lab，但王是第一个把这个系统引入apoptosis的人。所以，掘了第
一桶金。以前介绍过许田也是如此，第一个把tumor的概念引入drosophila，做出了漂亮的
工作。这个第一个才是重要的，王没有谈当时是否有忐忑的感受，但许是说了，他当时和
别人说这个idea之前，没有人理会他，倒是有不少嘲笑：）。我想，王在没找到ddATP之前
，也是极其郁闷的吧，这个时候，对自己的idea没有坚强的信念，是走不下去的。当然，
他也有一点点lucky：）
实际上，总有人固执地认为保守的是非常重要的，当然新的演化也是必须的和重要的。我
也觉得保守的通路不可被忽视。
关于凋亡的通路，就mammalian cell而言，现在主要集中在Death Receptor 和mitochond
r a pathway上，但这并不意味着这两条就是全部。
death receptor很重要，因为之不光介导stress－induced apoptosis，同时也介导免疫细
胞的apoptosis，体内实验也证实了这一点。而对mitochondria pathway事实上大部分数据
是建立在stress－induced apoptosis上，这个全世界都广为采用的系统极有可能夸大了c
ytochrome c的作用。因为实际上大家用的都是tumor cell line，而tumor的一大特征就是
获得avoid apoptosis的特性，所以，有可能mitochondria－independent apoptosis pat
hway 发生了loss/gain of function，而mitochondria pathway里的proteins stored in
mitochondria很少报道突变，比如cytochrome c，smac，Endo G。
通常这条pathway在tumor cell line里的变化只发生在其它调控蛋白上，比如BCL－2，XI
AP过表达之类。所以，一种解释可以说那些mitochondria蛋白有其它的生物学功能，对ce
llsurvival必须，所以，这样一来，就有可能使得在dish里培养的tumor cell line基本上
都依靠这条通路才能走向apoptosis。
所以，那篇genes&dev做出来的oncogene－induced apoptosis很重要，提示可能不光是st
ress，cytochrome c在其它的凋亡诱导途径中也起重要作用。早期作出来的是p53通过转录
下游effector作用在mitochondria上，这篇文章是c－myc。也许还有其它更多的，但可惜
现在还没有多少报道。
stress这种诱导方式太复杂，说不清楚,最终的结论还是要在体内得到才能下。有一点要说
明的是，caspase和mitochondria pathway是不能等同的。
相关蛋白的KO mice的建立也部分说明了mitochondria这条通路在发育中起重要作用。但这
些数据本身解释起来就很复杂，远远没有得出统一的结论，似乎这条pathway中的各个eff
ector都负责不同的组织的凋亡。
现在的热点，就象你说的，去研究cytochrome c和其它一大堆鬼东西怎么释放出来，真是
无聊极了，呵呵（个人喜好）。
我自己感觉在体内mitochondria pathway不是细胞首选自杀方式，改变现在的研究系统，
抛弃tumor cell line：）也许可以得出更多的有意思的东东。所以，线虫和果蝇才显得那
么重要，不然，有谁认为在果蝇里研究凋亡还有什么用？因为它们是in vivo，而不是仅仅
因为它们也保守。
