【原创】Westernblot基本流程与经验交流
丁香园论坛
2904
Westernblot基本流程
1.蛋白处理：此步骤是关键，蛋白处理的好否决定结果好坏。取细胞，3000rpm 3min离心，加入含蛋白酶抑制剂（现做现加）的细胞裂解液(本实验室选择RIPA，1×106/L细胞对应100ul)，枪尖反复吹吸裂解细胞（此步非常重要，容易出现鼻涕样的液体，此为裂解不充分的缘故，所以应反复吹打或者置于振荡器上，直至鼻涕状液体消失）。冰上放置至少半小时。
2.煮蛋白：12000rpm，15min离心，吸取上清，加入Loading buffer后于沸水中煮5min后,放于-80保存。
3.清水洗玻璃板，无水酒精擦洗干净，夹胶圈，防止漏胶。
4.配制10%分离胶，加入垂直板中，再加入1ml水液封（加入TEMED立即摇匀加入，加水液封时要缓慢些，防止把胶冲变形）。
5.20分钟后，把上清水倒掉，用滤纸把剩余的水吸干。配制5%浓缩胶（按1.5倍体积配液，保证足量），立即加入分离胶上层（绝对不能出现空泡），立即插梳子。10-20分钟后等胶凝固。
6.准备样品及marker、loading buffer，如果样品是之前保存的，则应再次煮沸5min。
7.将含胶的玻璃板装入电泳槽内，加入电极缓冲液（最好是新配制的），保证玻璃板内的液面高于玻璃板外。拔出梳子，拿注射器将每个加样孔吹一次，把其中可能存在的碎胶吹走，避免影响加样。
8.上样：本人上样有2个习惯。1.上样必须快些，如果上样时间超过半个小时以上，可能会出现孔中样品弥散出来。
2.每个孔均加40ul：样品40ul，Marker加完后再加Loading40ul，非上样孔上loading buffer40ul，保证整块胶重量平衡
9.电泳：本人采用恒流电泳，一块胶10mA（两块则20mA），等染料进入分离胶后，电流加大至20mA，总共约3-3.5h，电泳时周围可放置冰块，起到电泳槽散热的效果。
10.准备好电转液，滤纸、PVDF膜或者NC膜。电泳结束后，取下凝胶，Marker处做标志。上下各四层滤纸（5×8cm），下膜（5.5×8.5cm），上胶，本人用半干转移仪，电流设置为1块胶45mA，转移3.5h。（注意：1.滤纸、膜必须经过电转液浸泡，PVDF膜还得甲醇浸泡 2.上下滤纸之间不能有接触，避免短路 3.膜与胶之间不能有气泡 4. 正反极一定得正确，否则蛋白就转移到滤纸上了）
11.封闭：5%脱脂牛奶室温封闭2h或者4度封闭过夜
12.洗膜：含0.1%Tween-20的PBS洗涤三次，每次5min（提高Tween-20浓度可以去背景）
13.孵育一抗：室温2小时或者4度过夜。最好一次孵育最多两张膜，太多的膜可能一抗结合效果不佳。
14.洗膜：同前
15.孵育二抗：室温一小时（时间过长不宜），不推荐4度过夜
16.洗膜:同前
17.压片：具体步骤不赘述。注意点如下：1.压片时间得由ECL液中显影强度决定，短则2-10秒，长则2-5min
2.一般同时压2--4张片子，最底下那张一般太黑没法用。所以我最底下那张一般不换，压其他的膜也用这张做最底下一张，可以节省胶片
18.压过的膜还可以重新洗膜后孵育新的一抗、二抗。
这就是自己做Westernblot的一般流程，其中犯过很多错误，尤其是一些注意点其实都是自己的出错的地方。写出此贴，也是希望能帮助更多的朋友初步学习Westernblot，其中有不对的地方还希望大家批评指正。
1.蛋白处理：此步骤是关键，蛋白处理的好否决定结果好坏。取细胞，3000rpm 3min离心，加入含蛋白酶抑制剂（现做现加）的细胞裂解液(本实验室选择RIPA，1×106/L细胞对应100ul)，枪尖反复吹吸裂解细胞（此步非常重要，容易出现鼻涕样的液体，此为裂解不充分的缘故，所以应反复吹打或者置于振荡器上，直至鼻涕状液体消失）。冰上放置至少半小时。
2.煮蛋白：12000rpm，15min离心，吸取上清，加入Loading buffer后于沸水中煮5min后,放于-80保存。
3.清水洗玻璃板，无水酒精擦洗干净，夹胶圈，防止漏胶。
4.配制10%分离胶，加入垂直板中，再加入1ml水液封（加入TEMED立即摇匀加入，加水液封时要缓慢些，防止把胶冲变形）。
5.20分钟后，把上清水倒掉，用滤纸把剩余的水吸干。配制5%浓缩胶（按1.5倍体积配液，保证足量），立即加入分离胶上层（绝对不能出现空泡），立即插梳子。10-20分钟后等胶凝固。
6.准备样品及marker、loading buffer，如果样品是之前保存的，则应再次煮沸5min。
7.将含胶的玻璃板装入电泳槽内，加入电极缓冲液（最好是新配制的），保证玻璃板内的液面高于玻璃板外。拔出梳子，拿注射器将每个加样孔吹一次，把其中可能存在的碎胶吹走，避免影响加样。
8.上样：本人上样有2个习惯。1.上样必须快些，如果上样时间超过半个小时以上，可能会出现孔中样品弥散出来。
2.每个孔均加40ul：样品40ul，Marker加完后再加Loading40ul，非上样孔上loading buffer40ul，保证整块胶重量平衡
9.电泳：本人采用恒流电泳，一块胶10mA（两块则20mA），等染料进入分离胶后，电流加大至20mA，总共约3-3.5h，电泳时周围可放置冰块，起到电泳槽散热的效果。
10.准备好电转液，滤纸、PVDF膜或者NC膜。电泳结束后，取下凝胶，Marker处做标志。上下各四层滤纸（5×8cm），下膜（5.5×8.5cm），上胶，本人用半干转移仪，电流设置为1块胶45mA，转移3.5h。（注意：1.滤纸、膜必须经过电转液浸泡，PVDF膜还得甲醇浸泡 2.上下滤纸之间不能有接触，避免短路 3.膜与胶之间不能有气泡 4. 正反极一定得正确，否则蛋白就转移到滤纸上了）
11.封闭：5%脱脂牛奶室温封闭2h或者4度封闭过夜
12.洗膜：含0.1%Tween-20的PBS洗涤三次，每次5min（提高Tween-20浓度可以去背景）
13.孵育一抗：室温2小时或者4度过夜。最好一次孵育最多两张膜，太多的膜可能一抗结合效果不佳。
14.洗膜：同前
15.孵育二抗：室温一小时（时间过长不宜），不推荐4度过夜
16.洗膜:同前
17.压片：具体步骤不赘述。注意点如下：1.压片时间得由ECL液中显影强度决定，短则2-10秒，长则2-5min
2.一般同时压2--4张片子，最底下那张一般太黑没法用。所以我最底下那张一般不换，压其他的膜也用这张做最底下一张，可以节省胶片
18.压过的膜还可以重新洗膜后孵育新的一抗、二抗。
这就是自己做Westernblot的一般流程，其中犯过很多错误，尤其是一些注意点其实都是自己的出错的地方。写出此贴，也是希望能帮助更多的朋友初步学习Westernblot，其中有不对的地方还希望大家批评指正。
