【资源】EMSA条件优化

将最近看到一篇较好的文章中的英文翻译并整理如下啦^_^，错误之处请批评指正：

一、EMSA反应影响因素：
1、 DNA探针：探针可以和目的蛋白相结合，但同时也可以被其它蛋白非特异性结合，因此在得到特异性条带时也会有非特异性结合条带、“smear”探针条带或样品滞留不出孔。
2、 目的蛋白：同理目的蛋白除对其特异性结合的探针结合外，与竞争性反应中的非特异性DNA探针也有不同亲和力的结合，从而可以出现特异性结合条带或者与其它蛋白非特异聚集。
因此要优化探针与目的蛋白的量，使其能够达到产生特异性条带的最大量，同时又将探针或目的蛋白与反映中其它物质非特异性结合减至最低。

二、DNA结合反应条件优化如下图：
在一支1.5ml EP管中加入如下成分，30度孵育30min，加入少量EMSA loading buffer。


1. 成分加样顺序：最主要是要注意DNA与蛋白只能在最后一步接触。DNA探针只能与非特异竞争性探针一起或在其之后加入。
2. 温度：一般均在30度，但有的蛋白如sp1，在20度较好。
3. 时间：一般孵育为10－30min，对于大部分蛋白，这个时间已可饱和。
4. pH值：核提取物pH值应为6.5-8.5之间，最好为7.9。
5. 一价离子强度：一价阳离子浓度是决定特异性和非特异性复合物比例的重要因素。许多非特异性蛋白质－DNA反应是离子性的，因此可以被高盐浓度所抑制。但高盐亦可与DNA的磷酸骨架反应导致DNA复合物断裂。所以若使用核蛋白粗提物，盐离子浓度最好于50－100mM之间，也有些因结构较稳定可以耐受200mM。
6. 二价离子：最多为Mg2＋，其优化浓度为0－10mM，试验时可用5mM尝试。它可以加速蛋白质与DNA的反应，其中包括结合和裂解，因此优化时最好尝试Mg2＋（＋）和Mg2＋（－）两种情况。Zn2＋或Cd2＋等阳离子有时可以增加DNA-蛋白质之间的结合，也可以消除电泳缓冲液中的金属螯合剂的影响。
7. 非离子性去污剂如NP-40、TritonX100，或Tween可以减少蛋白聚集，从而减少smear条带及DNA探针滞留孔中的情况。一般使用0.1-0.2%NP-40。有时高浓度（1－2％）亦可用于增加结合。
8. 蛋白样品：在20ul反应提醒中应从2－20ug进行试验优化，找出最佳量，一般核抽提物含有2－4ug/ul。
9. 非特异竞争探针：此探针的种类和量都需要优化，从而才能得到敏感、特异的检测结果。