【原创】新人马上要做western，贴出protocol和每日步骤，一为求大神指点解惑，二可与各位同仁相互交流

新的不能再新的菜鸟，没有师兄师姐带，也没有实验室老师带，完全自己摸索，到各个同学那里蹭经验。马上要做western，故将总结的western经验步骤po上来，一为求各位坛子里的大神垂怜，可以给予指导解惑，二来，也可与各位即将做western的新人一起交流心得，分享失败教训经验。若有不当之处，还请各位前辈、同仁给予指出，叩谢。
明日开始从提蛋白开始，今先po一部分步骤，明天晚上来汇报结果。

一、细胞总蛋白提取：
1、PIPA（碧云天）按100:1加入PMSF（碧云天），置于冰上备用；
2、取25cm培养瓶（鼻咽癌贴壁细胞），4℃PBS清洗1min×3次，留1mlPBS，细胞刮顺方向刮下细胞，收集于2mlEP管中，2500rpm/5min，弃上清；
3、加入200ulRIPA，置于冰上30min，中间反复吹打细胞；
4、13000rpm/20min，4℃，取上清，10ul一管分装，-20℃冻存。
二、BCA法测蛋白浓度：
1、BCA试剂（碧云天）A：B=50:1配成工作液，4℃备用；
2、用PBS稀释BSA，10ul至100ul，浓度为0.5mg/ml；
3、96孔板内
1(PBS+BSA) 2（PBS+样品）
A 20+0 19+1
B 19+1 19+1
C 18+2 19+1
D 16+4
E 12+8
F 8+12
G 4+16
H 0+20
20UL 20UL
4、各孔加入200ulBCA工作液，37℃，30min；
5、测A562nm处OD值，绘制标准曲线，测定样品蛋白浓度；
6、样品上样前处理：若为多种样品，则用RIPA稀释为相同浓度，加入5×LB（稀释至1×），100℃水浴加热3-15min，变性蛋白，-20℃备用。
三、配胶
1、组装制胶装置，加入纯水，定时10min，检查有无漏液；
2、根据碧云天分离胶配置方法，配置分离胶（约5ml一块板），因我目的蛋白和内参GADPH在35-65kd，故选取12%配置；
3、沿玻璃板加入分离胶至距玻璃顶1.5cm，纯水小心封闭，勿冲散分离胶，定时30min；
4、凝固后，可见胶、水分离线，倒去纯水，倒置，吸水纸小心吸干；
5、配置浓缩胶（约2ml一块板,两块板3ml也够），立即插入梳子，过程中不要产生气泡，20min胶凝固后，组装电泳内槽，加入电泳液后水平拔出梳子。