【交流】通过文献，进一步认识EB－没有那么恐怖
丁香园论坛
832
在生化区引发了一篇关于AO和EB染色细胞DNA的文献，应该发在这区比较合适，这里做基因的人肯定很多，和各位交流一下，EB为啥都传得那么可怕，我从来没有查到关于EB对于哺乳动物致癌的文章，反而找到了不少文献证明了EB根本无法穿透正常完整细胞膜，也就无从插入正常活细胞的DNA，更谈不上传说中的强致癌。以下是文献，大家还可以去自己搜索，另外，让我担心的是现在很多实验室都用国产核酸染料代替EB，有些核酸染料其实就是AO,它比EB更加可怕，可以穿透正常活细胞膜而插入DNA。
用文献来说话
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/112323_1.html 链接的文章至少说明EB对于完整活体细胞的穿透力比某些核酸染料好低。
下文是链接的文章，想看更多的证据请点击链接
陈丽娟 盛瑞兰 汪承亚 朱广荣
作者单位：210029 南京医科大学第一附属医院
细胞凋亡与肿瘤的发生和治疗之间的关系是近年来国际上研究的热点，目前细胞凋亡的检测方法有DNA凝胶电泳法、电子显微镜法、染料透过法、TUNEL法和流式细胞仪法等。我们用染料透过检测法［1］测定阿糖胞苷(Ara-C)诱导的HL-60细胞凋亡，取得了满意的结果，现报道如下。
材料和方法
1 原理 吖啶橙(AO)能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光。溴乙锭(E仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。凋亡的细胞呈现为染色增强，荧光更为明亮，均匀一致的圆状或固缩状、团块状结构。非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。二者形态迥然相异，很易判别。在荧光显微镜下观察，可见四种细胞形态：活细胞(VN)，核染色质着绿色并呈正常结构；早期凋亡细胞(VA)，核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状；非凋亡的死亡细胞(NVN)，核染色质着橘红色并呈正常结构；晚期凋亡细胞(NVA)，核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状。细胞凋亡率由以下公式计算：
2 材料 细胞来源：HL-60细胞株，由南京铁道医学院血液科研究室提供。
AO/EB染料: 精确称取AO(Fluka产品)、EB(Fluka产品 )各1mg，分别溶于10ml pH7.2 PBS中使之配成100μg/ml的储备液，用前等量混合，备用。
3 方法
3.1 HL-60细胞培养：将1×106/ml HL-60细胞接种于含20％小牛血清的RPMI 1640培养液中，加Ara-C终浓度为10μg/ml，置37℃、5％CO2浓度及饱和湿度的恒温培养箱中悬浮培养，孵育后分别于3，6，12，24及48小时观察结果。
3.2 AO/EB染色及观察结果：取细胞悬液 100μl，加入AO/EB染料4μl混匀，置1滴于载玻片，上覆盖玻片，荧光显微镜下观察结果并计数200个细胞。
3.3 DNA抽提及电泳：用酚、氯仿、异戊醇抽提DNA，1.5％琼脂糖凝胶电泳(0.5×TBE缓冲液，电压30V，电泳7～8小时)，在紫外透射仪下观察结果并拍照。
结 果
Ara-C诱导HL-60细胞凋亡，在0，3，6，12，24和48小时其凋亡率分别为1.5%，14%，57.5%，66%，70.5%和60.5%。实验显示于第6小时开始，随诱导时间延长，其凋亡率增高，但观察至48小时，凋亡率却减低，此时显微镜下可见许多细胞碎片(附表）。DNA电泳在Ara-C诱导6小时后均见梯形条带。
讨 论
Ara-C是作用于细胞S期的特异性抗代谢药物，临床上用于各种白血病的治疗，过去认为其作用机制是杀细胞性的，但近年来认为小剂量Ara-C有诱导分化作用。本实验显示Ara-C的作用机制是诱导细胞凋亡，且诱导作用在24小时内随诱导时间延长，其凋亡率逐渐增高，而经药物作用48小时后细胞凋亡率反而减低，并且在显微镜下可见较多的细胞碎片，考虑为细胞凋亡后继发性坏死所致，由于碎片无法计数，故导致计数时凋亡细胞相对减少，凋亡率相对下降。
附表 Ara-C诱导的HL-60细胞凋亡
组别 时间 细胞计数(%) 凋亡率
(%) 膜受损细胞率
(%)
VN NVN VA NVA 合计
1 0 196 1 2 1 200 1.5 1.0
2 3 169 3 26 2 200 14.0 2.5
3 6 81 4 112 3 200 57.5 3.5
4 12 52 16 109 23 200 66.0 19.5
5 24 41 18 112 29 200 70.5 23.5
6 48 59 20 90 31 200 60.5 21.5
在人体内凋亡细胞常被邻近的吞噬细胞所吞噬清除，因此不会发生继发性坏死。本实验亦显示经Ara-C诱导的HL-60细胞于6小时后DNA电泳均显现梯形条带，此结果进一步证实了Ara-C对HL-60细胞的诱导凋亡作用。
测定细胞凋亡的方法有多种，其特点各不相同。DNA电泳法仅可定性，但无定量作用，而AO/EB染色法则可以半定量，它不但可以检测细胞的凋亡率，而且还能了解膜受损细胞率。AO/EB法所需设备少、简便、快捷、经济，便于推广。其主要缺陷是仍难避免操作者的主观因素，最好由两位操作者同时计数，每次实验重复3次，计算平均凋亡率。电镜检测法设备昂贵，操作复杂，且仅有定性作用；TUNEL法和流式细胞仪法虽也有定量作用，但TUNEL法也带有主观性，且TUNEL法和流式细胞仪价格昂贵，难以普及。我们介绍的AO/EB染色法是研究细胞凋亡的重要检测方法，随着此法的应用和推广，对抗肿瘤药物作用机制的研究及临床用药的指导将起重要作用。
参 考 文 献
1 Wang CY, Eshleman J,Lutterbaugh J,et al.Spontaneous apoptosis in human colon tumour cell lines and the relation of WT p53 to apoptosis.Chin Med J,1996，109:537-541.
(收稿：1996-12-16 修回：1997-05-08)
(校对：张吉贤)
中华血液学杂志
ZHONGHUA XUEYEXUE ZAZHI
CHINESE JOURNAL OF HEMATOLOGY
1998年 第1期 No.1 JANUARY 1998
用文献来说话
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/112323_1.html 链接的文章至少说明EB对于完整活体细胞的穿透力比某些核酸染料好低。
下文是链接的文章，想看更多的证据请点击链接
陈丽娟 盛瑞兰 汪承亚 朱广荣
作者单位：210029 南京医科大学第一附属医院
细胞凋亡与肿瘤的发生和治疗之间的关系是近年来国际上研究的热点，目前细胞凋亡的检测方法有DNA凝胶电泳法、电子显微镜法、染料透过法、TUNEL法和流式细胞仪法等。我们用染料透过检测法［1］测定阿糖胞苷(Ara-C)诱导的HL-60细胞凋亡，取得了满意的结果，现报道如下。
材料和方法
1 原理 吖啶橙(AO)能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光。溴乙锭(E仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。凋亡的细胞呈现为染色增强，荧光更为明亮，均匀一致的圆状或固缩状、团块状结构。非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。二者形态迥然相异，很易判别。在荧光显微镜下观察，可见四种细胞形态：活细胞(VN)，核染色质着绿色并呈正常结构；早期凋亡细胞(VA)，核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状；非凋亡的死亡细胞(NVN)，核染色质着橘红色并呈正常结构；晚期凋亡细胞(NVA)，核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状。细胞凋亡率由以下公式计算：
2 材料 细胞来源：HL-60细胞株，由南京铁道医学院血液科研究室提供。
AO/EB染料: 精确称取AO(Fluka产品)、EB(Fluka产品 )各1mg，分别溶于10ml pH7.2 PBS中使之配成100μg/ml的储备液，用前等量混合，备用。
3 方法
3.1 HL-60细胞培养：将1×106/ml HL-60细胞接种于含20％小牛血清的RPMI 1640培养液中，加Ara-C终浓度为10μg/ml，置37℃、5％CO2浓度及饱和湿度的恒温培养箱中悬浮培养，孵育后分别于3，6，12，24及48小时观察结果。
3.2 AO/EB染色及观察结果：取细胞悬液 100μl，加入AO/EB染料4μl混匀，置1滴于载玻片，上覆盖玻片，荧光显微镜下观察结果并计数200个细胞。
3.3 DNA抽提及电泳：用酚、氯仿、异戊醇抽提DNA，1.5％琼脂糖凝胶电泳(0.5×TBE缓冲液，电压30V，电泳7～8小时)，在紫外透射仪下观察结果并拍照。
结 果
Ara-C诱导HL-60细胞凋亡，在0，3，6，12，24和48小时其凋亡率分别为1.5%，14%，57.5%，66%，70.5%和60.5%。实验显示于第6小时开始，随诱导时间延长，其凋亡率增高，但观察至48小时，凋亡率却减低，此时显微镜下可见许多细胞碎片(附表）。DNA电泳在Ara-C诱导6小时后均见梯形条带。
讨 论
Ara-C是作用于细胞S期的特异性抗代谢药物，临床上用于各种白血病的治疗，过去认为其作用机制是杀细胞性的，但近年来认为小剂量Ara-C有诱导分化作用。本实验显示Ara-C的作用机制是诱导细胞凋亡，且诱导作用在24小时内随诱导时间延长，其凋亡率逐渐增高，而经药物作用48小时后细胞凋亡率反而减低，并且在显微镜下可见较多的细胞碎片，考虑为细胞凋亡后继发性坏死所致，由于碎片无法计数，故导致计数时凋亡细胞相对减少，凋亡率相对下降。
附表 Ara-C诱导的HL-60细胞凋亡
组别 时间 细胞计数(%) 凋亡率
(%) 膜受损细胞率
(%)
VN NVN VA NVA 合计
1 0 196 1 2 1 200 1.5 1.0
2 3 169 3 26 2 200 14.0 2.5
3 6 81 4 112 3 200 57.5 3.5
4 12 52 16 109 23 200 66.0 19.5
5 24 41 18 112 29 200 70.5 23.5
6 48 59 20 90 31 200 60.5 21.5
在人体内凋亡细胞常被邻近的吞噬细胞所吞噬清除，因此不会发生继发性坏死。本实验亦显示经Ara-C诱导的HL-60细胞于6小时后DNA电泳均显现梯形条带，此结果进一步证实了Ara-C对HL-60细胞的诱导凋亡作用。
测定细胞凋亡的方法有多种，其特点各不相同。DNA电泳法仅可定性，但无定量作用，而AO/EB染色法则可以半定量，它不但可以检测细胞的凋亡率，而且还能了解膜受损细胞率。AO/EB法所需设备少、简便、快捷、经济，便于推广。其主要缺陷是仍难避免操作者的主观因素，最好由两位操作者同时计数，每次实验重复3次，计算平均凋亡率。电镜检测法设备昂贵，操作复杂，且仅有定性作用；TUNEL法和流式细胞仪法虽也有定量作用，但TUNEL法也带有主观性，且TUNEL法和流式细胞仪价格昂贵，难以普及。我们介绍的AO/EB染色法是研究细胞凋亡的重要检测方法，随着此法的应用和推广，对抗肿瘤药物作用机制的研究及临床用药的指导将起重要作用。
参 考 文 献
1 Wang CY, Eshleman J,Lutterbaugh J,et al.Spontaneous apoptosis in human colon tumour cell lines and the relation of WT p53 to apoptosis.Chin Med J,1996，109:537-541.
(收稿：1996-12-16 修回：1997-05-08)
(校对：张吉贤)
中华血液学杂志
ZHONGHUA XUEYEXUE ZAZHI
CHINESE JOURNAL OF HEMATOLOGY
1998年 第1期 No.1 JANUARY 1998
