【交流】关于质粒提取注意的地方
丁香园论坛
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这是我第3天小提质粒了，每次最后看到的都是可怜的沉淀，心里也特别难受，可是难受也没有办法，需要的是冷静的分析原因，于是打算进行质粒大提了，还要把所有的试剂都重新配制，包括ＬＢ培养基。可在此之前，我想请教一下，碱变性法提取质粒各位都有什么地方是特别注意的。为我的最后大提请愿，希望顺利。
1、我自己觉得首先是心态问题，说实话，这个实验我已经做了无数次了，这次是最失败的一次，３天连提都失败，本来国庆想休息一下的，现在彻底无望了；
2、其次是试剂问题，我用的试剂都是一次性配好放在４度保存，因为小提用量很少，所以配好２００ｍｌ的溶液可以用很久，所以我担心是试剂失效了，因为最后一次，我连E.ColipUC19都一起提了，还是无果。
3、在加完P1.P2.P3，和异丙醇后我会得到还算多的沉淀，可是用TE却怎么也无法溶解，所以最后就只能用枪吹成悬浊液，然后进行Rnase消化，用苯酚氯仿，和氯仿异戊醇纯化后，再用乙醇沉淀就发现，没有从前我看到的呈缠绕丝状沉淀，而是像雾一样很轻很细小的白色沉淀，这时候我就觉得肯定没有质粒了，所以我在想，是不是在前面就没有把细胞溶解释放出DNA来，但是加完P1.P2.P3时感觉现象都有，很正常，然后离心取上清，加入异丙醇后也有沉淀，但是干燥后用TE无法溶解。不知道是什么原因。
而且从下面是我在网上转载的前面三个最重要的溶液的配制和原理，可以看出来溶解2主要负责溶解细胞，可是我今天小提所用的溶解2是昨天刚配的，NaOH是我直接换算后称量的固体，应该也没有问题啊。
1、 溶液Ｉ:pH8.0 GET缓冲液（50mmol葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/L Tris－HCl）；溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/i%H6_.]9z7O6l3gn2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15min，贮存于４℃。葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2＋ 和Mg2 ＋等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉。从而起到抑制DNase对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。
2、 溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH(内含1％的SDS)，这个用的时候需现配。要新配置溶液Ⅱ是为了避免NaOH接触空气中的 CO2而减弱了碱性。NaOH是最佳溶解细胞的试剂。不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会在瞬间溶
解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化。用不新鲜的0.4 N NaOH，即便有SDS也无法有效溶解大肠杆菌。SDS是离子型表面活性剂。它主要作用是：a溶解细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏细胞膜。b解聚细胞中的核蛋白。c能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。 SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下来的提取过程必须把它去除干净，以便下一步试验的更好进行。
3、 溶液Ⅲ：pH4.8乙酸钾溶液（60ml 5mol/L KAc，11.5ml冰醋酸，28.5mlH2O）；该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L. pH4.8的乙酸钾溶液是为了把抽提液的pH调至中性，从而使变性的质粒DNA复性，且稳定存在。溶液III加入后的沉淀实际上是K+置换了SDS中的Na+形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚，使得沉淀更完全。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而 互相聚合，后者是因为盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的盐形式复合物。
我现在苦于找不到愿因，不想蛮干了，希望大家能帮助我，走出这个怪圈，也提前祝同志们节日快乐，虽然我没有节日可言了:(
1、我自己觉得首先是心态问题，说实话，这个实验我已经做了无数次了，这次是最失败的一次，３天连提都失败，本来国庆想休息一下的，现在彻底无望了；
2、其次是试剂问题，我用的试剂都是一次性配好放在４度保存，因为小提用量很少，所以配好２００ｍｌ的溶液可以用很久，所以我担心是试剂失效了，因为最后一次，我连E.ColipUC19都一起提了，还是无果。
3、在加完P1.P2.P3，和异丙醇后我会得到还算多的沉淀，可是用TE却怎么也无法溶解，所以最后就只能用枪吹成悬浊液，然后进行Rnase消化，用苯酚氯仿，和氯仿异戊醇纯化后，再用乙醇沉淀就发现，没有从前我看到的呈缠绕丝状沉淀，而是像雾一样很轻很细小的白色沉淀，这时候我就觉得肯定没有质粒了，所以我在想，是不是在前面就没有把细胞溶解释放出DNA来，但是加完P1.P2.P3时感觉现象都有，很正常，然后离心取上清，加入异丙醇后也有沉淀，但是干燥后用TE无法溶解。不知道是什么原因。
而且从下面是我在网上转载的前面三个最重要的溶液的配制和原理，可以看出来溶解2主要负责溶解细胞，可是我今天小提所用的溶解2是昨天刚配的，NaOH是我直接换算后称量的固体，应该也没有问题啊。
1、 溶液Ｉ:pH8.0 GET缓冲液（50mmol葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/L Tris－HCl）；溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/i%H6_.]9z7O6l3gn2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15min，贮存于４℃。葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2＋ 和Mg2 ＋等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉。从而起到抑制DNase对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。
2、 溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH(内含1％的SDS)，这个用的时候需现配。要新配置溶液Ⅱ是为了避免NaOH接触空气中的 CO2而减弱了碱性。NaOH是最佳溶解细胞的试剂。不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会在瞬间溶
解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化。用不新鲜的0.4 N NaOH，即便有SDS也无法有效溶解大肠杆菌。SDS是离子型表面活性剂。它主要作用是：a溶解细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏细胞膜。b解聚细胞中的核蛋白。c能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。 SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下来的提取过程必须把它去除干净，以便下一步试验的更好进行。
3、 溶液Ⅲ：pH4.8乙酸钾溶液（60ml 5mol/L KAc，11.5ml冰醋酸，28.5mlH2O）；该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L. pH4.8的乙酸钾溶液是为了把抽提液的pH调至中性，从而使变性的质粒DNA复性，且稳定存在。溶液III加入后的沉淀实际上是K+置换了SDS中的Na+形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚，使得沉淀更完全。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而 互相聚合，后者是因为盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的盐形式复合物。
我现在苦于找不到愿因，不想蛮干了，希望大家能帮助我，走出这个怪圈，也提前祝同志们节日快乐，虽然我没有节日可言了:(
