【原创】酶切问题

最近总是看到一些战友发帖求助有关酶切方面的问题，因为它影响到了后续的重组质粒构建，而且似乎都无从说起。但我认为考虑全面了还是有章可循的。

1 ：目的载体的控制
无论它是空载体还是已经插入片段的载体，都必须保证：
A ：质粒最好新鲜抽提，且抽提后电泳显示正常。质粒的长期保存形式建议以平板上的单克隆置于四度或者冻干状态于负20度，菌种尽可能以高浓度甘油状态置于负80度。
B ：质粒的多克隆位点经测序后显示正确，尤其是表达载体，需要用正反向引物测到表达起始位点，防止移码。对于外来的质粒，或者传过几代的质粒务必采取此措施求个保险。

2 ：酶的控制
无论用到的是限制性内切酶，还是去磷酸化酶，各种DNA连接酶等等，都要养成良好的操作习惯：
A ：常用的Buffer置于四度，最好标注上日期，有条件的定期更换。
B ：加酶时务必带上冰盒，及时放回。
C ：对于质粒正常，用酶处理后条带全无的情况，首先考虑核酸酶污染，更换新酶后酶切正常要及时做标记，完全确定后丢弃受污染的酶。

3 ：酶切的控制
A ：温度，根据该酶的特性确定。两者不相同时必须双酶切则以温度低的为准。
B ：时间，以二到三小时为准，酶切过夜应适当增加质粒的量。星号活性迄今为止我遇到的很少。
C ：酶的用量，双酶切体系中，在共用Buffer中活性低的酶适当加量，其它情况以1ul酶切少于1ug质粒为准，不确定的情况下设置梯度实验。
D ：酶切体系，20，30，50，100均可，加完后低速离心混匀。
E ：可选用PCR管等薄壁管水浴或者培养箱温浴。
F ：必须分步酶切的以先低盐后高盐为准则。
G ：酶切后产物建议胶回收，对后续连接非常有好处。

4 ：PCR产物的酶切
A ：两端应习惯加上三个保护碱基，基本不会有问题。
B ：酶切时间，适当延长。
C ：PCR产物的量，越多越亮越好。

5 ：酶切位点的选择
A ：无论双酶切还是单酶切都必须保证它是唯一且存在的。
B ：两酶切位点之间保持距离，若无法避免，仅间隔几个碱基，则建议分步酶切，避免两者互相影响，原则是以所需保护碱基少的酶作为后切的对象。
B ：其余参考下面的链接
http://www.dxy.cn/bbs/thread/13063919

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