【交流】Southern 杂交与Northern 杂交技术！
丁香园论坛
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本人做的植物转基因技术方向，由于要做一些杂交技术来验证外源基因的整合与表达情况，故将自己在做实验中遇到的一些问题以及注意事项想告诉大家，同时希望和朋友们一起交流探讨。
Southern Blot:
1.首先是提取大量DNA，由于不同的材料的基因组大小不一样，故上样量也不同，但上样量还是要大一些为好，一般30-50微克左右，若你的DNA质量非常好，一般20微克左右就可以，有的材料如獐茅10微克就可以。
注意，上样量与DNA质量，一定要用氯仿异戊醇抽提2遍，在用酚氯仿异戊醇抽提一次。
2. DNA酶切与精致
酶切体系在300-500微升，酶切体系越大切的越完全。
注：体系中先不加酶，在4℃放置4h，其间每隔15min，摇混一次，然后就加半量的酶，消化2h后再加入另一半。
3. 探针标记
严格按着试剂盒操作进行，我们一般用的都是地高辛试剂盒，感觉很不错。
注：将lμg制备好的探针用灭菌的ddH2O稀释至16μl，沸水浴10min变性，之后迅速置冰上冷却5min。将DIG高效标记试剂充分混合，取4μl加到己变性的DNA混合物中，短暂离心，置于37℃水浴过夜。用的时候在变性一次。
4.转膜：
将跑好的胶进行变性1小时，中和1小时，然后开始转膜，一般建议采用毛细管转膜过夜，我们同时采用真空转膜与毛细管转膜，毛细管效果要好一些！
注：毛细步骤：准备一容器，内装部分20×SSC，同时制备一个支持平台，平台上覆盖以三层滤纸做成的纸桥，纸桥的两端浸在20×SSC中，注意排除气泡；
将胶放置在纸桥上，排除气泡，四周以保鲜膜环绕以防止SSC直接被纸巾吸收；
剪下略大于凝胶的尼龙膜和滤纸（2张）将其在蒸馏水中浸泡5～10min。
将膜放在胶上，避免产生气泡，剪与胶一样大的滤纸三张，用10×SSC 浸湿后放在膜上，同样避免产生气泡；
在滤纸上放置5～7cm的吸水纸巾，纸巾上放置一玻璃板和重物，放置过夜；
去除尼龙膜上面的全部物品，膜与胶一起移走，将膜一侧放置在一张干净的滤纸上，在烘箱中80℃烘干45min或在254nm紫外光下光照5min以固定DNA于膜上。
5.杂交
预杂交：42度预杂交缓慢摇晃1个小时，预杂交之前应先将预杂交液预热到42度。
杂交：将标记好的探针在沸水中变性10min，然后取出迅速放入冰浴中，待冷却后，将探针加入杂交液(探针终浓度为25ng/ml)，42℃振荡14～18h。
6.洗膜：
①将杂交后的膜取出，用2×SSC，0.1% SDS在15～25℃漂洗2次，每次5min，漂洗过程中不停摇动；
②然后用用0.5×SSC，0.1% SDS在65～68℃漂洗2次，每次15min，漂洗过程中不停摇动；
③用Washing buffer洗5min，2次；
④将膜放入100ml Blocking solution中温育30min，漂洗过程中不停摇动；
⑤将膜放入100ml Antibody solution中温育30min，漂洗过程中不停摇动；
⑥用100ml Washing buffer洗15min，2次，漂洗过程中不停摇动；
⑦用20ml Detection buffer漂洗2～5min。取出尼龙膜用滤纸吸干，加入1ml地高辛化学发光底物，用保鲜膜包好，然后在15～25℃放置5min，漂洗过程中不停摇动；
⑧将保鲜膜赶平，在37℃烘箱中放置10min。
注：Blocking solution与Antibody solution一定要先配先用！68度一定要充分洗膜。
7.显影
①将用保鲜膜包裹的膜放入X光匣中，将DNA面与X光胶片相贴，曝光15～20min；
②在暗室中，取出X光胶片，置显影液中显影10min，停影3min，在定影液中定影10min后，用清水冲洗后晾干，观察杂交结果。
注，可以同时放两张底片，若下面那张背景较重，则上面的一张应该比较适宜！
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Northern blot:
关键是提RNA的步骤，一定要防止降解，且上样量也要足够大，做的时候最好是将样品研磨充分后将TRIZAL放入研钵中，待溶解后，在放入离心管中。
提取风干后用去离子甲酰胺溶解，其溶解度很大，一般每微升可以溶解1微克，且还可以防止RNA降解，效果很好呀！
(1) 凝胶的制备。
如准备100ml凝胶需要加入：琼脂糖1g；10×MOPS缓冲液10ml；经DEPC处理的水73 ml；加热溶化凝胶，混匀，凉至50℃时加入17ml 37%的甲醛，混匀，倒胶制板，甲醛有毒且易挥发，制备变性胶应在通风橱内操作，电泳时应盖严电泳槽；
(2) RNA样品的准备：总RNA通常需要50μg，溶于上样缓冲液中，在沸水浴中加热样品2min，冰上冷却样品；
(3) 凝胶电泳：以1×MOPS缓冲液作为电泳缓冲液，5～7.5V/cm跑胶2～3h，或者等到溴酚蓝迁移到胶的3/4处时停止电泳；
(4) 凝胶的处理：在DEPC水中浸泡胶15min，重复3次，缓冲液要足够使胶在容器内漂浮；
(5) 转膜、探针标记、杂交和检测均同Southern杂交部分。
好了，就写到这儿吧，祝大家好运呀！有问题我们在讨论呀！
Southern Blot:
1.首先是提取大量DNA，由于不同的材料的基因组大小不一样，故上样量也不同，但上样量还是要大一些为好，一般30-50微克左右，若你的DNA质量非常好，一般20微克左右就可以，有的材料如獐茅10微克就可以。
注意，上样量与DNA质量，一定要用氯仿异戊醇抽提2遍，在用酚氯仿异戊醇抽提一次。
2. DNA酶切与精致
酶切体系在300-500微升，酶切体系越大切的越完全。
注：体系中先不加酶，在4℃放置4h，其间每隔15min，摇混一次，然后就加半量的酶，消化2h后再加入另一半。
3. 探针标记
严格按着试剂盒操作进行，我们一般用的都是地高辛试剂盒，感觉很不错。
注：将lμg制备好的探针用灭菌的ddH2O稀释至16μl，沸水浴10min变性，之后迅速置冰上冷却5min。将DIG高效标记试剂充分混合，取4μl加到己变性的DNA混合物中，短暂离心，置于37℃水浴过夜。用的时候在变性一次。
4.转膜：
将跑好的胶进行变性1小时，中和1小时，然后开始转膜，一般建议采用毛细管转膜过夜，我们同时采用真空转膜与毛细管转膜，毛细管效果要好一些！
注：毛细步骤：准备一容器，内装部分20×SSC，同时制备一个支持平台，平台上覆盖以三层滤纸做成的纸桥，纸桥的两端浸在20×SSC中，注意排除气泡；
将胶放置在纸桥上，排除气泡，四周以保鲜膜环绕以防止SSC直接被纸巾吸收；
剪下略大于凝胶的尼龙膜和滤纸（2张）将其在蒸馏水中浸泡5～10min。
将膜放在胶上，避免产生气泡，剪与胶一样大的滤纸三张，用10×SSC 浸湿后放在膜上，同样避免产生气泡；
在滤纸上放置5～7cm的吸水纸巾，纸巾上放置一玻璃板和重物，放置过夜；
去除尼龙膜上面的全部物品，膜与胶一起移走，将膜一侧放置在一张干净的滤纸上，在烘箱中80℃烘干45min或在254nm紫外光下光照5min以固定DNA于膜上。
5.杂交
预杂交：42度预杂交缓慢摇晃1个小时，预杂交之前应先将预杂交液预热到42度。
杂交：将标记好的探针在沸水中变性10min，然后取出迅速放入冰浴中，待冷却后，将探针加入杂交液(探针终浓度为25ng/ml)，42℃振荡14～18h。
6.洗膜：
①将杂交后的膜取出，用2×SSC，0.1% SDS在15～25℃漂洗2次，每次5min，漂洗过程中不停摇动；
②然后用用0.5×SSC，0.1% SDS在65～68℃漂洗2次，每次15min，漂洗过程中不停摇动；
③用Washing buffer洗5min，2次；
④将膜放入100ml Blocking solution中温育30min，漂洗过程中不停摇动；
⑤将膜放入100ml Antibody solution中温育30min，漂洗过程中不停摇动；
⑥用100ml Washing buffer洗15min，2次，漂洗过程中不停摇动；
⑦用20ml Detection buffer漂洗2～5min。取出尼龙膜用滤纸吸干，加入1ml地高辛化学发光底物，用保鲜膜包好，然后在15～25℃放置5min，漂洗过程中不停摇动；
⑧将保鲜膜赶平，在37℃烘箱中放置10min。
注：Blocking solution与Antibody solution一定要先配先用！68度一定要充分洗膜。
7.显影
①将用保鲜膜包裹的膜放入X光匣中，将DNA面与X光胶片相贴，曝光15～20min；
②在暗室中，取出X光胶片，置显影液中显影10min，停影3min，在定影液中定影10min后，用清水冲洗后晾干，观察杂交结果。
注，可以同时放两张底片，若下面那张背景较重，则上面的一张应该比较适宜！
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Northern blot:
关键是提RNA的步骤，一定要防止降解，且上样量也要足够大，做的时候最好是将样品研磨充分后将TRIZAL放入研钵中，待溶解后，在放入离心管中。
提取风干后用去离子甲酰胺溶解，其溶解度很大，一般每微升可以溶解1微克，且还可以防止RNA降解，效果很好呀！
(1) 凝胶的制备。
如准备100ml凝胶需要加入：琼脂糖1g；10×MOPS缓冲液10ml；经DEPC处理的水73 ml；加热溶化凝胶，混匀，凉至50℃时加入17ml 37%的甲醛，混匀，倒胶制板，甲醛有毒且易挥发，制备变性胶应在通风橱内操作，电泳时应盖严电泳槽；
(2) RNA样品的准备：总RNA通常需要50μg，溶于上样缓冲液中，在沸水浴中加热样品2min，冰上冷却样品；
(3) 凝胶电泳：以1×MOPS缓冲液作为电泳缓冲液，5～7.5V/cm跑胶2～3h，或者等到溴酚蓝迁移到胶的3/4处时停止电泳；
(4) 凝胶的处理：在DEPC水中浸泡胶15min，重复3次，缓冲液要足够使胶在容器内漂浮；
(5) 转膜、探针标记、杂交和检测均同Southern杂交部分。
好了，就写到这儿吧，祝大家好运呀！有问题我们在讨论呀！
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